Účinnekontrola komárova znížiť výskyt chorôb, ktoré prenášajú, sú potrebné strategické, udržateľné a ekologické alternatívy k chemickým pesticídom. Hodnotili sme semenné šroty z určitých kapustovitých (čeľaď Brassica) ako zdroj rastlinných izotiokyanátov vyrobených enzymatickou hydrolýzou biologicky neaktívnych glukozinolátov na použitie pri kontrole egyptského Aedes (L., 1762). Päťnásobne odtučnený semenný šrot (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 a Thlaspi arvense – tri hlavné typy tepelnej inaktivácie a enzymatickej degradácie Chemické produkty Na stanovenie toxicity (LC50) alylizotiokyanátu, benzylizotiokyanátu a 4-hydroxybenzylizotiokyanátu pre larvy Aedes aegypti pri 24-hodinovej expozícii = 0,04 g/120 ml dH2O). Hodnoty LC50 pre horčicu, bielu horčicu a prasličku boli 0,05, 0,08 a 0,05 v porovnaní s alylizotiokyanátom (LC50 = 19,35 ppm) a 4,2-hydroxybenzylizotiokyanátom (LC50 = 55,41 ppm) ktorý bol toxickejší pre larvy 24 hodín po ošetrení ako 0,1 g/120 ml dH2O. Tieto výsledky sú v súlade s produkciou múčky zo semien lucerny. Vyššia účinnosť benzylesterov zodpovedá vypočítaným hodnotám LC50. Použitie múčky môže poskytnúť účinnú metódu kontroly komárov. Táto štúdia popisuje účinnosť prášku zo semien kapustovitých a jeho hlavných chemických zložiek proti larvám komárov a ukazuje, ako môžu prírodné zlúčeniny v prášku zo semien kapustovitých slúžiť ako sľubný ekologický larvicíd na kontrolu komárov.
Choroby prenášané vektormi spôsobené komármi rodu Aedes zostávajú hlavným globálnym problémom verejného zdravia. Výskyt chorôb prenášaných komármi sa geograficky šíri1,2,3 a opätovne sa objavuje, čo vedie k prepuknutiu závažných ochorení4,5,6,7. Šírenie chorôb medzi ľuďmi a zvieratami (napr. chikungunya, dengue, horúčka údolia Rift, žltá zimnica a vírus Zika) je bezprecedentné. Len samotná horúčka dengue vystavuje v trópoch riziku infekcie približne 3,6 miliardy ľudí, pričom ročne sa vyskytne odhadom 390 miliónov infekcií, čo má za následok 6 100 – 24 300 úmrtí ročne8. Opätovný výskyt a prepuknutie vírusu Zika v Južnej Amerike pritiahli celosvetovú pozornosť kvôli poškodeniu mozgu, ktoré spôsobuje u detí narodených infikovaným ženám2. Kremer a kol.3 predpovedajú, že geografický rozsah komárov rodu Aedes sa bude naďalej rozširovať a že do roku 2050 bude polovica svetovej populácie vystavená riziku infekcie arbovírusmi prenášanými komármi.
S výnimkou nedávno vyvinutých vakcín proti horúčke dengue a žltej zimnici ešte neboli vyvinuté vakcíny proti väčšine chorôb prenášaných komármi9,10,11. Vakcíny sú stále dostupné v obmedzenom množstve a používajú sa iba v klinických skúškach. Kontrola prenášačov komárov pomocou syntetických insekticídov je kľúčovou stratégiou na kontrolu šírenia chorôb prenášaných komármi12,13. Hoci syntetické pesticídy sú účinné pri usmrcovaní komárov, pokračujúce používanie syntetických pesticídov negatívne ovplyvňuje necieľové organizmy a znečisťuje životné prostredie14,15,16. Ešte alarmujúcejší je trend zvyšovania odolnosti komárov voči chemickým insekticídom17,18,19. Tieto problémy spojené s pesticídmi urýchlili hľadanie účinných a ekologických alternatív na kontrolu prenášačov chorôb.
Ako zdroje fytopesticídov na kontrolu škodcov boli vyvinuté rôzne rastliny20,21. Rastlinné látky sú vo všeobecnosti šetrné k životnému prostrediu, pretože sú biologicky odbúrateľné a majú nízku alebo zanedbateľnú toxicitu pre necieľové organizmy, ako sú cicavce, ryby a obojživelníky20,22. Je známe, že bylinné prípravky produkujú rôzne bioaktívne zlúčeniny s rôznymi mechanizmami účinku na účinnú kontrolu rôznych životných štádií komárov23,24,25,26. Zlúčeniny rastlinného pôvodu, ako sú éterické oleje a iné aktívne rastlinné zložky, si získali pozornosť a vydláždili cestu pre inovatívne nástroje na kontrolu prenášačov komárov. Éterické oleje, monoterpény a seskviterpény pôsobia ako repelenty, odstrašujúce látky proti potrave a ovicídy27,28,29,30,31,32,33. Mnohé rastlinné oleje spôsobujú smrť lariev, kukiel a dospelých komárov34,35,36, čo ovplyvňuje nervový, dýchací, endokrinný a iné dôležité systémy hmyzu37.
Nedávne štúdie poskytli prehľad o potenciálnom využití horčičných rastlín a ich semien ako zdroja bioaktívnych zlúčenín. Horčičná múčka bola testovaná ako biofumigant38,39,40,41 a používaná ako pôdna prísada na potlačenie buriny42,43,44 a kontrolu pôdnych rastlinných patogénov45,46,47,48,49,50, výživu rastlín, nematódy41,51, 52, 53, 54 a škodcovia55, 56, 57, 58, 59, 60. Fungicídna aktivita týchto práškov zo semien sa pripisuje ochranným zlúčeninám rastlín nazývaným izotiokyanáty38,42,60. V rastlinách sú tieto ochranné zlúčeniny uložené v rastlinných bunkách vo forme nebioaktívnych glukozinolátov. Keď sú však rastliny poškodené hmyzom alebo infekciou patogénmi, glukozinoláty sú hydrolyzované myrozinázou na bioaktívne izotiokyanáty55,61. Izotiokyanáty sú prchavé zlúčeniny, o ktorých je známe, že majú širokospektrálnu antimikrobiálnu a insekticídnu aktivitu a ich štruktúra, biologická aktivita a obsah sa medzi druhmi čeľade Brassicaceae značne líšia42,59,62,63.
Hoci je známe, že izotiokyanáty získané z horčičnej múčky majú insekticídnu aktivitu, chýbajú údaje o biologickej aktivite proti medicínsky významným článkonožcovým vektorom. Naša štúdia skúmala larvicídnu aktivitu štyroch odtučnených práškov zo semien proti komárom Aedes. Larvy Aedes aegypti. Cieľom štúdie bolo vyhodnotiť ich potenciálne využitie ako ekologických biopesticídov na kontrolu komárov. Tri hlavné chemické zložky múčky zo semien, alylizotiokyanát (AITC), benzylizotiokyanát (BITC) a 4-hydroxybenzylizotiokyanát (4-HBITC), boli tiež testované na overenie biologickej aktivity týchto chemických zložiek na larvy komárov. Toto je prvá správa, ktorá hodnotí účinnosť štyroch práškov zo semien kapusty a ich hlavných chemických zložiek proti larvám komárov.
Laboratórne kolónie Aedes aegypti (kmeň Rockefeller) boli udržiavané pri teplote 26 °C, relatívnej vlhkosti 70 % a 10:14 h (fotoperióda L:D). Spárené samice boli umiestnené v plastových klietkach (výška 11 cm a priemer 9,5 cm) a kŕmené pomocou systému kŕmenia z fľaše s použitím citrátovej hovädzej krvi (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, USA). Kŕmenie krvou sa vykonávalo ako obvykle pomocou membránového viacskleneného kŕmidla (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, USA) pripojeného k cirkulačnej trubici vodného kúpeľa (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, USA) s reguláciou teploty 37 °C. Na dno každej sklenenej kŕmnej komory (plocha 154 mm2) sa natiahla fólia Parafilm M. Každé kŕmidlo sa potom umiestnilo na hornú mriežku zakrývajúcu klietku s páriacou sa samicou. Približne 350 – 400 μl hovädzej krvi sa pridalo do skleneného podávacieho lievika pomocou Pasteurovej pipety (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a dospelé červy sa nechali odkvapkať aspoň jednu hodinu. Gravidné samice potom dostali 10 % roztok sacharózy a nechali sa naklásť vajíčka na vlhký filtračný papier vystlaný v jednotlivých ultrapriehľadných suflé pohárikoch (veľkosť 1,25 fl oz, Dart Container Corp., Mason, MI, USA). Filtračný papier s vajíčkami sa umiestnil do uzavretého vrecka (SC Johnsons, Racine, WI) a uskladnil sa pri teplote 26 °C. Vajíčka sa vyliahli a približne 200 – 250 lariev sa chovalo v plastových miskách obsahujúcich zmes králičej stravy (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) a pečeňového prášku (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA) a rybieho filé (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Nemecko) v pomere 2:1:1. V našich biologických testoch boli použité larvy neskorého tretieho instaru.
Materiál semien rastlín použitý v tejto štúdii bol získaný z nasledujúcich komerčných a vládnych zdrojov: Brassica juncea (hnedá horčica - Pacific Gold) a Brassica juncea (biela horčica - Ida Gold) od Pacific Northwest Farmers' Cooperative, štát Washington, USA; (žerucha záhradná) od Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, USA a Thlaspi arvense (poľná kresba - Elisabeth) od USDA-ARS, Peoria, IL, USA; Žiadne zo semien použitých v štúdii nebolo ošetrené pesticídmi. Všetok materiál semien bol spracovaný a použitý v tejto štúdii v súlade s miestnymi a národnými predpismi a v súlade so všetkými príslušnými miestnymi štátnymi a národnými predpismi. Táto štúdia neskúmala transgénne odrody rastlín.
Semená Brassica juncea (PG), Alfalfa (Ls), biela horčica (IG) a Thlaspi arvense (DFP) boli zomleté na jemný prášok pomocou ultracentrifugálneho mlyna Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Nemecko) vybaveného okami s veľkosťou ôk 0,75 mm a rotorom z nehrdzavejúcej ocele, 12 zubov, 10 000 ot./min. (Tabuľka 1). Prášok zo zomletých semien bol prenesený do papierovej misky a odtučnený hexánom v Soxhletovom prístroji počas 24 hodín. Podvzorka odtučnenej horčice poľnej bola tepelne upravená pri teplote 100 °C počas 1 hodiny, aby sa denaturovala myrozináza a zabránilo sa hydrolýze glukozinolátov za vzniku biologicky aktívnych izotiokyanátov. Tepelne upravený prášok zo semien prasličky (DFP-HT) bol použitý ako negatívna kontrola denaturáciou myrozinázy.
Obsah glukozinolátov v odtučnenom semennom šrotu sa stanovil trojmo pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) podľa predtým publikovaného protokolu 64. Stručne povedané, k 250 mg vzorke odtučneného semenného prášku sa pridali 3 ml metanolu. Každá vzorka sa sonikovala vo vodnom kúpeli 30 minút a nechala sa 16 hodín v tme pri teplote 23 °C. 1 ml alikvotná časť organickej vrstvy sa potom prefiltrovala cez 0,45 μm filter do automatického vzorkovača. Obsah glukozinolátov v semennom šrotu sa stanovil trojmo pomocou softvéru Shimadzu LC Solution verzie 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA) na systéme Shimadzu HPLC (dve pumpy LC 20AD; automatický vzorkovač SIL 20A; odplyňovač DGU 20As; UV-VIS detektor SPD-20A na monitorovanie pri 237 nm; a komunikačný zbernicový modul CBM-20A). Použitá kolóna bola kolóna s reverznou fázou C18 Inertsil (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, USA). Počiatočné podmienky mobilnej fázy boli nastavené na 12 % metanol/88 % 0,01 M tetrabutylamóniumhydroxid vo vode (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) s prietokom 1 ml/min. Po injekcii 15 μl vzorky boli počiatočné podmienky udržiavané 20 minút a potom bol pomer rozpúšťadla upravený na 100 % metanol s celkovým časom analýzy vzorky 65 minút. Štandardná krivka (na báze nM/mAb) bola vytvorená sériovým riedením čerstvo pripravených štandardov sinapínu, glukozinolátu a myrozínu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) na odhad obsahu síry v odtučnenom semennom šrotu. Koncentrácie glukozinolátov vo vzorkách boli testované na HPLC systéme Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) s použitím softvéru OpenLAB CDS ChemStation verzie (C.01.07 SR2 [255]) vybaveného rovnakou kolónou a s použitím predtým opísanej metódy. Koncentrácie glukozinolátov boli stanovené tak, aby boli porovnateľné medzi HPLC systémami.
Allylizotiokyanát (94 %, stabilný) a benzylizotiokyanát (98 %) boli zakúpené od spoločnosti Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 4-Hydroxybenzylizotiokyanát bol zakúpený od spoločnosti ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Pri enzymatickej hydrolýze myrozinázou tvoria glukozinoláty, glukozinoláty a glukozinoláty alylizotiokyanát, benzylizotiokyanát a 4-hydroxybenzylizotiokyanát.
Laboratórne biologické testy boli vykonané podľa metódy Muturiho a kol.32 s modifikáciami. V štúdii bolo použitých päť nízkotučných semenných krmív: DFP, DFP-HT, IG, PG a Ls. Dvadsať lariev bolo umiestnených do 400 ml jednorazovej trojcestnej kadičky (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) obsahujúcej 120 ml deionizovanej vody (dH2O). Na toxicitu lariev komárov bolo testovaných sedem koncentrácií semennej múčky: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 a 0,12 g semennej múčky/120 ml dH2O pre semennú múčku DFP, DFP-HT, IG a PG. Predbežné biologické testy naznačujú, že odtučnená semenná múčka Ls je toxickejšia ako štyri iné testované semenné múčky. Preto sme upravili sedem koncentrácií semennej múčky Ls na nasledujúce koncentrácie: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 a 0,075 g/120 ml dH2O.
Na posúdenie normálnej úmrtnosti hmyzu za podmienok testu bola zahrnutá neošetrená kontrolná skupina (dH20, bez prídavku semennej múčky). Toxikologické biologické testy pre každú semennú múčku zahŕňali tri opakované kadičky s tromi sklonmi (20 lariev neskorého tretieho instaru na kadičku), celkovo 108 ampuliek. Ošetrené nádoby boli skladované pri izbovej teplote (20 – 21 °C) a úmrtnosť lariev bola zaznamenávaná počas 24 a 72 hodín nepretržitého vystavenia liečebným koncentráciám. Ak sa telo a prívesky komára pri prepichnutí alebo dotyku tenkou špachtľou z nehrdzavejúcej ocele nepohnú, larvy komárov sa považujú za mŕtve. Mŕtve larvy zvyčajne zostávajú nehybné v dorzálnej alebo ventrálnej polohe na dne nádoby alebo na hladine vody. Experiment sa opakoval trikrát v rôzne dni s použitím rôznych skupín lariev, celkovo 180 lariev vystavených každej liečebnej koncentrácii.
Toxicita AITC, BITC a 4-HBITC pre larvy komárov bola hodnotená rovnakým postupom biotestu, ale s rôznymi úpravami. Pre každú chemikáliu sa pripravili zásobné roztoky s koncentráciou 100 000 ppm pridaním 100 µl chemikálie do 900 µl absolútneho etanolu v 2 ml centrifugačnej skúmavke a pretrepávaním počas 30 sekúnd, aby sa dôkladne premiešali. Koncentrácie liečby boli stanovené na základe našich predbežných biotestov, ktoré zistili, že BITC je oveľa toxickejší ako AITC a 4-HBITC. Na stanovenie toxicity sa použilo 5 koncentrácií BITC (1, 3, 6, 9 a 12 ppm), 7 koncentrácií AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 a 35 ppm) a 6 koncentrácií 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 a 35 ppm, teda 30, 45, 60, 75 a 90 ppm). Kontrolnej skupine bolo injekčne podaných 108 μl absolútneho etanolu, čo zodpovedá maximálnemu objemu chemickej úpravy. Biologické testy sa opakovali ako je uvedené vyššie, pričom sa na každú koncentráciu ošetrenia vystavilo celkovo 180 lariev. Mortalita lariev sa zaznamenala pre každú koncentráciu AITC, BITC a 4-HBITC po 24 hodinách nepretržitej expozície.
Probitová analýza 65 údajov o úmrtnosti súvisiacej s dávkou bola vykonaná pomocou softvéru Polo (Polo Plus, LeOra Software, verzia 1.0) na výpočet 50 % letálnej koncentrácie (LC50), 90 % letálnej koncentrácie (LC90), sklonu, koeficientu letálnej dávky a 95 % letálnej koncentrácie na základe intervalov spoľahlivosti pre pomery letálnych dávok pre logaritmicky transformované krivky koncentrácie a dávky a úmrtnosti. Údaje o úmrtnosti sú založené na kombinovaných opakovaných údajoch 180 lariev vystavených každej liečebnej koncentrácii. Pravdepodobnostné analýzy boli vykonané samostatne pre každú semennú múčku a každú chemickú zložku. Na základe 95 % intervalu spoľahlivosti pomeru letálnych dávok bola toxicita semennej múčky a chemických zložiek pre larvy komárov považovaná za významne odlišnú, takže interval spoľahlivosti s hodnotou 1 nebol významne odlišný, P = 0,0566.
Výsledky HPLC na stanovenie hlavných glukozinolátov v odtučnených múkach zo semien DFP, IG, PG a Ls sú uvedené v tabuľke 1. Hlavné glukozinoláty v testovaných múkach zo semien sa líšili s výnimkou DFP a PG, ktoré obe obsahovali glukozinoláty myrozinázy. Obsah myrozinínu v PG bol vyšší ako v DFP, 33,3 ± 1,5 a 26,5 ± 0,9 mg/g. Prášok zo semien Ls obsahoval 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglykónu, zatiaľ čo prášok zo semien IG obsahoval 38,0 ± 0,5 mg/g sinapínu.
Larvy komárov druhu Ae. Aedes aegypti boli usmrtené po ošetrení odtučneným semenným múčkou, hoci účinnosť ošetrenia sa líšila v závislosti od druhu rastliny. Iba DFP-NT nebol toxický pre larvy komárov po 24 a 72 hodinách expozície (Tabuľka 2). Toxicita aktívneho semenného prášku sa zvyšovala so zvyšujúcou sa koncentráciou (Obr. 1A, B). Toxicita semenného múčky pre larvy komárov sa významne líšila na základe 95 % intervalu spoľahlivosti pomeru letálnych dávok hodnôt LC50 pri 24-hodinovom a 72-hodinovom hodnotení (Tabuľka 3). Po 24 hodinách bol toxický účinok semenného múčky Ls väčší ako pri iných ošetreniach semenným múčkou s najvyššou aktivitou a maximálnou toxicitou pre larvy (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Larvy boli po 24 hodinách menej citlivé na DFP v porovnaní s ošetrením práškom zo semien IG, Ls a PG, s hodnotami LC50 0,115, 0,04 a 0,08 g/120 ml dH2O, ktoré boli štatisticky vyššie ako hodnota LC50 0,211 g/120 ml dH2O (Tabuľka 3). Hodnoty LC90 DFP, IG, PG a Ls boli 0,376, 0,275, 0,137 a 0,074 g/120 ml dH2O (Tabuľka 2). Najvyššia koncentrácia DPP bola 0,12 g/120 ml dH2O. Po 24 hodinách hodnotenia bola priemerná úmrtnosť lariev iba 12 %, zatiaľ čo priemerná úmrtnosť lariev IG a PG dosiahla 51 % a 82 %. Po 24 hodinách hodnotenia bola priemerná úmrtnosť lariev pri najvyššej koncentrácii semennej múčky Ls (0,075 g/120 ml dH2O) 99 % (obr. 1A).
Krivky úmrtnosti boli odhadnuté z dávkovej odpovede (Probit) lariev Ae. egyptského (larvy 3. instaru) na koncentráciu semennej múčky 24 hodín (A) a 72 hodín (B) po ošetrení. Prerušovaná čiara predstavuje LC50 ošetrenia semennou múčkou. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Teplom inaktivovaná Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Pri 72-hodinovom hodnotení boli hodnoty LC50 semennej múčky DFP, IG a PG 0,111, 0,085 a 0,051 g/120 ml dH2O. Takmer všetky larvy vystavené semennej múčke Ls uhynuli po 72 hodinách expozície, takže údaje o úmrtnosti boli v rozpore s Probitovou analýzou. V porovnaní s inými semennými múčkami boli larvy menej citlivé na ošetrenie semennou múčkou DFP a mali štatisticky vyššie hodnoty LC50 (tabuľky 2 a 3). Po 72 hodinách boli hodnoty LC50 pre ošetrenie semennou múčkou DFP, IG a PG odhadnuté na 0,111, 0,085 a 0,05 g/120 ml dH2O. Po 72 hodinách hodnotenia boli hodnoty LC90 semenných práškov DFP, IG a PG 0,215, 0,254 a 0,138 g/120 ml dH2O. Po 72 hodinách hodnotenia bola priemerná úmrtnosť lariev pri ošetrení semennou múčkou DFP, IG a PG pri maximálnej koncentrácii 0,12 g/120 ml dH2O 58 %, 66 % a 96 % (obr. 1B). Po 72-hodinovom hodnotení sa zistilo, že semenná múčka PG je toxickejšia ako semenná múčka IG a DFP.
Syntetické izotiokyanáty, alylizotiokyanát (AITC), benzylizotiokyanát (BITC) a 4-hydroxybenzylizotiokyanát (4-HBITC) dokážu účinne ničiť larvy komárov. 24 hodín po ošetrení bol BITC toxickejší pre larvy s hodnotou LC50 5,29 ppm v porovnaní s 19,35 ppm pre AITC a 55,41 ppm pre 4-HBITC (Tabuľka 4). V porovnaní s AITC a BITC má 4-HBITC nižšiu toxicitu a vyššiu hodnotu LC50. Existujú významné rozdiely v toxicite dvoch hlavných izotiokyanátov (Ls a PG) pre larvy komárov v najúčinnejšej semennej múčke. Toxicita založená na pomere letálnych dávok hodnôt LC50 medzi AITC, BITC a 4-HBITC ukázala štatistický rozdiel tak, že 95 % interval spoľahlivosti pomeru letálnych dávok LC50 nezahŕňal hodnotu 1 (P = 0,05, Tabuľka 4). Odhaduje sa, že najvyššie koncentrácie BITC aj AITC usmrtili 100 % testovaných lariev (obrázok 2).
Krivky úmrtnosti boli odhadnuté z dávkovej odozvy (Probit) Ae. 24 hodín po ošetrení dosiahli egyptské larvy (larvy 3. instaru) koncentrácie syntetických izotiokyanátov. Prerušovaná čiara predstavuje LC50 pre ošetrenie izotiokyanátom. Benzylizotiokyanát BITC, alylizotiokyanát AITC a 4-HBITC.
Použitie rastlinných biopesticídov ako činidiel na kontrolu prenášačov komárov je už dlho skúmané. Mnohé rastliny produkujú prírodné chemikálie, ktoré majú insekticídnu aktivitu37. Ich bioaktívne zlúčeniny predstavujú atraktívnu alternatívu k syntetickým insekticídom s veľkým potenciálom v kontrole škodcov vrátane komárov.
Horčičné rastliny sa pestujú ako plodina pre svoje semená, používajú sa ako korenie a zdroj oleja. Keď sa horčičný olej extrahuje zo semien alebo keď sa horčica extrahuje na použitie ako biopalivo,69 vedľajším produktom je odtučnená semenná múčka. Táto semenná múčka si zachováva mnoho svojich prirodzených biochemických zložiek a hydrolytických enzýmov. Toxicita tejto semennej múčky sa pripisuje produkcii izotiokyanátov55,60,61. Izotiokyanáty vznikajú hydrolýzou glukozinolátov enzýmom myrozinázou počas hydratácie semennej múčky38,55,70 a je známe, že majú fungicídne, baktericídne, nematocídne a insekticídne účinky, ako aj ďalšie vlastnosti vrátane chemických senzorických účinkov a chemoterapeutických vlastností61,62,70. Niekoľko štúdií ukázalo, že horčičné rastliny a semenná múčka účinne pôsobia ako fumiganty proti pôdnym a skladovaným potravinovým škodcom57,59,71,72. V tejto štúdii sme hodnotili toxicitu štvorsemennej múčky a jej troch bioaktívnych produktov AITC, BITC a 4-HBITC pre larvy komára Aedes. Aedes aegypti. Očakáva sa, že pridanie semennej múčky priamo do vody obsahujúcej larvy komárov aktivuje enzymatické procesy, ktoré produkujú izotiokyanáty toxické pre larvy komárov. Táto biotransformácia bola čiastočne preukázaná pozorovanou larvicídnou aktivitou semennej múčky a stratou insekticídnej aktivity, keď bola múčka z horčičných semien zakrpatej pred použitím tepelne upravená. Očakáva sa, že tepelné ošetrenie zničí hydrolytické enzýmy, ktoré aktivujú glukozinoláty, čím sa zabráni tvorbe bioaktívnych izotiokyanátov. Toto je prvá štúdia, ktorá potvrdzuje insekticídne vlastnosti prášku zo semien kapusty proti komárom vo vodnom prostredí.
Spomedzi testovaných práškov zo semien bol prášok zo semien žeruchy lekárskej (Ls) najtoxickejší, pričom spôsoboval vysokú úmrtnosť Aedes albopictus. Larvy Aedes aegypti boli spracovávané nepretržite 24 hodín. Zostávajúce tri prášky zo semien (PG, IG a DFP) mali pomalšiu aktivitu a stále spôsobovali významnú úmrtnosť aj po 72 hodinách nepretržitého ošetrenia. Iba múčka zo semien Ls obsahovala významné množstvo glukozinolátov, zatiaľ čo PG a DFP obsahovali myrozinázu a IG obsahoval glukozinolát ako hlavný glukozinolát (Tabuľka 1). Glukotropaeolín sa hydrolyzuje na BITC a sinalbín sa hydrolyzuje na 4-HBITC61,62. Výsledky našich biologických testov naznačujú, že múčka zo semien Ls aj syntetický BITC sú vysoko toxické pre larvy komárov. Hlavnou zložkou múčky zo semien PG a DFP je glukozinolát myrozinázy, ktorý sa hydrolyzuje na AITC. AITC je účinný pri usmrcovaní lariev komárov s hodnotou LC50 19,35 ppm. V porovnaní s AITC a BITC je izotiokyanát 4-HBITC najmenej toxický pre larvy. Hoci je AITC menej toxický ako BITC, jeho hodnoty LC50 sú nižšie ako u mnohých esenciálnych olejov testovaných na larvách komárov32,73,74,75.
Náš prášok zo semien kapustovitých rastlín určený na použitie proti larvám komárov obsahuje jeden hlavný glukozinolát, ktorý predstavuje viac ako 98 – 99 % z celkového množstva glukozinolátov, stanovené pomocou HPLC. Boli zistené stopové množstvá iných glukozinolátov, ale ich hladiny boli nižšie ako 0,3 % z celkového množstva glukozinolátov. Prášok zo semien žeruchy siatej (L. sativum) obsahuje sekundárne glukozinoláty (sinigrín), ale ich podiel je 1 % z celkového množstva glukozinolátov a ich obsah je stále nevýznamný (približne 0,4 mg/g prášku zo semien). Hoci PG a DFP obsahujú rovnaký hlavný glukozinolát (myrozín), larvicídna aktivita ich semenných múčok sa výrazne líši v dôsledku ich hodnôt LC50. Líši sa v toxicite voči múčnatke. Výskyt lariev Aedes aegypti môže byť spôsobený rozdielmi v aktivite myrozinázy alebo stabilite medzi týmito dvoma semennými krmivami. Aktivita myrozinázy hrá dôležitú úlohu v biologickej dostupnosti produktov hydrolýzy, ako sú izotiokyanáty, v rastlinách Brassicaceae76. Predchádzajúce správy Pococka a kol.77 a Wilkinsona a kol.78 ukázali, že zmeny v aktivite a stabilite myrozinázy môžu byť spojené aj s genetickými a environmentálnymi faktormi.
Očakávaný obsah bioaktívnych izotiokyanátov bol vypočítaný na základe hodnôt LC50 každej semennej múčky po 24 a 72 hodinách (Tabuľka 5) na porovnanie so zodpovedajúcimi chemickými aplikáciami. Po 24 hodinách boli izotiokyanáty v semennej múčke toxickejšie ako čisté zlúčeniny. Hodnoty LC50 vypočítané na základe počtu častíc na milión (ppm) izotiokyanátov pri ošetrení semien boli nižšie ako hodnoty LC50 pri aplikáciách BITC, AITC a 4-HBITC. Pozorovali sme larvy konzumujúce pelety semennej múčky (Obrázok 3A). V dôsledku toho môžu byť larvy vystavené koncentrovanejšej expozícii toxickým izotiokyanátom požitím peliet semennej múčky. Toto bolo najzreteľnejšie pri ošetrení semennej múčky IG a PG pri 24-hodinovej expozícii, kde boli koncentrácie LC50 o 75 % a 72 % nižšie ako pri ošetrení čistým AITC a 4-HBITC. Ošetrenia Ls a DFP boli toxickejšie ako čistý izotiokyanát, s hodnotami LC50 o 24 % a 41 % nižšími. Larvy v kontrolnej skupine sa úspešne zakuklili (obr. 3B), zatiaľ čo väčšina lariev v skupine so semennou múčkou sa nezakuklila a vývoj lariev sa výrazne oneskoril (obr. 3B,D). U Spodopteralitura sú izotiokyanáty spojené s retardáciou rastu a vývojovým oneskorením79.
Larvy komárov druhu Ae. Aedes aegypti boli nepretržite vystavené prášku zo semien Brassica počas 24 – 72 hodín. (A) Mŕtve larvy s časticami semennej múčky v ústnych častiach (zakrúžkované); (B) Kontrolná liečba (dH20 bez pridania semennej múčky) ukazuje, že larvy rastú normálne a začínajú sa kukliť po 72 hodinách. (C, D) Larvy ošetrené semennou múčkou; semenná múčka vykazovala rozdiely vo vývoji a nezakuklila sa.
Neštudovali sme mechanizmus toxických účinkov izotiokyanátov na larvy komárov. Predchádzajúce štúdie na červených ohnivých mravcoch (Solenopsis invicta) však ukázali, že inhibícia glutatión S-transferázy (GST) a esterázy (EST) je hlavným mechanizmom bioaktivity izotiokyanátov a AITC, dokonca aj pri nízkej aktivite, môže tiež inhibovať aktivitu GST. červené importované ohnivé mravce v nízkych koncentráciách. Dávka je 0,5 µg/ml80. Naproti tomu AITC inhibuje acetylcholínesterázu u dospelých nosatcov kukuričných (Sitophilus zeamais)81. Podobné štúdie je potrebné vykonať na objasnenie mechanizmu aktivity izotiokyanátov v larvách komárov.
Na podporu návrhu, že hydrolýza rastlinných glukozinolátov za vzniku reaktívnych izotiokyanátov slúži ako mechanizmus na kontrolu lariev komárov pomocou horčičnej múčky, používame tepelne inaktivovaný DFP. Semenná múčka DFP-HT nebola pri testovaných aplikačných dávkach toxická. Lafarga a kol. 82 uviedli, že glukozinoláty sú citlivé na degradáciu pri vysokých teplotách. Očakáva sa tiež, že tepelné ošetrenie denaturuje enzým myrozinázu v semennej múčke a zabráni hydrolýze glukozinolátov za vzniku reaktívnych izotiokyanátov. Toto potvrdili aj Okunade a kol. 75, ktorí ukázali, že myrozináza je citlivá na teplotu, čo dokazuje, že aktivita myrozinázy bola úplne inaktivovaná, keď boli semená horčice, čiernej horčice a krvavej horčice vystavené teplotám nad 80 °C. Tieto mechanizmy môžu viesť k strate insekticídnej aktivity tepelne ošetrenej semennej múčky DFP.
Horčičná múčka a jej tri hlavné izotiokyanáty sú teda toxické pre larvy komárov. Vzhľadom na tieto rozdiely medzi semennou múčkou a chemickým ošetrením môže byť použitie semennej múčky účinnou metódou kontroly komárov. Je potrebné identifikovať vhodné formulácie a účinné systémy dodávania na zlepšenie účinnosti a stability používania semenných práškov. Naše výsledky naznačujú potenciálne použitie horčičnej múčky ako alternatívy k syntetickým pesticídom. Táto technológia by sa mohla stať inovatívnym nástrojom na kontrolu prenášačov komárov. Keďže larvy komárov prosperujú vo vodnom prostredí a glukozinoláty zo semennej múčky sa po hydratácii enzymaticky premieňajú na aktívne izotiokyanáty, použitie horčičnej múčky vo vode zamorenej komármi ponúka významný kontrolný potenciál. Hoci sa larvicídna aktivita izotiokyanátov líši (BITC > AITC > 4-HBITC), je potrebný ďalší výskum, aby sa zistilo, či kombinácia semennej múčky s viacerými glukozinolátmi synergicky zvyšuje toxicitu. Toto je prvá štúdia, ktorá demonštruje insekticídne účinky odtučnenej semennej múčky z kapustovitých rastlín a troch bioaktívnych izotiokyanátov na komáre. Výsledky tejto štúdie prinášajú nový pohľad na svet tým, že ukazujú, že odtučnená múčka z kapustových semien, vedľajší produkt extrakcie oleja zo semien, môže slúžiť ako sľubný larvicídny prostriedok na kontrolu komárov. Tieto informácie môžu pomôcť pri ďalšom objavovaní biochemických prostriedkov na kontrolu rastlín a ich vývoji ako lacných, praktických a ekologických biopesticídov.
Súbory údajov vygenerované pre túto štúdiu a výsledné analýzy sú k dispozícii od príslušného autora na základe primeranej žiadosti. Na konci štúdie boli všetky materiály použité v štúdii (hmyz a semenná múčka) zničené.
Čas uverejnenia: 29. júla 2024