Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie najlepších výsledkov odporúčame používať novšiu verziu prehliadača (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Kombinácie insekticídnych zlúčenín rastlinného pôvodu môžu vykazovať synergické alebo antagonistické interakcie proti škodcom. Vzhľadom na rýchle šírenie chorôb prenášaných komármi rodu Aedes a rastúcu odolnosť populácií komárov rodu Aedes voči tradičným insekticídom bolo formulovaných a testovaných dvadsaťosem kombinácií terpénových zlúčenín na báze rastlinných esenciálnych olejov proti larválnym a dospelým štádiám Aedes aegypti. Päť rastlinných esenciálnych olejov (EO) bolo pôvodne hodnotených z hľadiska ich larvicídnej účinnosti a účinnosti u dospelých jedincov a v každom EO boli na základe výsledkov GC-MS identifikované dve hlavné zlúčeniny. Boli zakúpené hlavné identifikované zlúčeniny, a to diallyldisulfid, diallyltrisulfid, karvón, limonén, eugenol, metyleugenol, eukalyptol, eudesmol a alfa-pinén proti komárom. Následne boli pripravené binárne kombinácie týchto zlúčenín s použitím subletálnych dávok a boli testované a stanovené ich synergické a antagonistické účinky. Najlepšie larvicídne zloženia sa získajú zmiešaním limonénu s diallyldisulfidom a najlepšie adulticídne zloženia sa získajú zmiešaním karvónu s limonénom. Komerčne používaný syntetický larvicíd Temphos a liek pre dospelých Malathion boli testované samostatne a v binárnych kombináciách s terpenoidmi. Výsledky ukázali, že najúčinnejšou kombináciou bola kombinácia temefosu a diallyldisulfidu a malatiónu a eudesmolu. Tieto silné kombinácie majú potenciál na použitie proti Aedes aegypti.
Rastlinné esenciálne oleje (EO) sú sekundárne metabolity obsahujúce rôzne bioaktívne zlúčeniny a stávajú sa čoraz dôležitejšou alternatívou k syntetickým pesticídom. Nielenže sú šetrné k životnému prostrediu a užívateľsky prívetivé, ale sú aj zmesou rôznych bioaktívnych zlúčenín, čo tiež znižuje pravdepodobnosť vzniku rezistencie na liečivá1. Pomocou technológie GC-MS výskumníci skúmali zložky rôznych rastlinných esenciálnych olejov a identifikovali viac ako 3 000 zlúčenín zo 17 500 aromatických rastlín2, z ktorých väčšina bola testovaná na insekticídne vlastnosti a uvádza sa, že majú insekticídne účinky3,4. Niektoré štúdie zdôrazňujú, že toxicita hlavnej zložky zlúčeniny je rovnaká alebo vyššia ako toxicita jej surového etylénoxidu. Použitie jednotlivých zlúčenín však môže opäť ponechať priestor pre rozvoj rezistencie, ako je to v prípade chemických insekticídov5,6. Preto sa súčasný dôraz kladie na prípravu zmesí zlúčenín na báze etylénoxidu s cieľom zlepšiť insekticídnu účinnosť a znížiť pravdepodobnosť vzniku rezistencie v cieľových populáciách škodcov. Jednotlivé účinné látky prítomné v éterických olejoch (EO) môžu vykazovať synergické alebo antagonistické účinky v kombináciách odrážajúcich celkovú aktivitu EO, čo je fakt, ktorý bol zdôraznený v štúdiách predchádzajúcich výskumníkov7,8. Program kontroly vektorov zahŕňa aj EO a jeho zložky. Mosquitocídna aktivita esenciálnych olejov bola rozsiahlo študovaná na komároch Culex a Anopheles. Niekoľko štúdií sa pokúsilo vyvinúť účinné pesticídy kombináciou rôznych rastlín s komerčne používanými syntetickými pesticídmi s cieľom zvýšiť celkovú toxicitu a minimalizovať vedľajšie účinky9. Štúdie takýchto zlúčenín proti Aedes aegypti však zostávajú zriedkavé. Pokroky v lekárskej vede a vývoj liekov a vakcín pomohli v boji proti niektorým chorobám prenášaným vektormi. Prítomnosť rôznych sérotypov vírusu, ktoré prenáša komár Aedes aegypti, však viedla k zlyhaniu očkovacích programov. Preto, keď sa takéto choroby vyskytnú, programy kontroly vektorov sú jedinou možnosťou, ako zabrániť šíreniu choroby. V súčasnej situácii je kontrola Aedes aegypti veľmi dôležitá, pretože je kľúčovým prenášačom rôznych vírusov a ich sérotypov spôsobujúcich horúčku dengue, Ziku, hemoragickú horúčku dengue, žltú zimnicu atď. Najpozoruhodnejšia je skutočnosť, že počet prípadov takmer všetkých chorôb prenášaných vektormi Aedes v Egypte každoročne rastie a rastie aj na celom svete. Preto je v tejto súvislosti naliehavo potrebné vyvinúť ekologické a účinné kontrolné opatrenia pre populácie Aedes aegypti. Potenciálnymi kandidátmi v tomto ohľade sú esenciálne aminokyseliny (EO), ich zložky a ich kombinácie. Preto sa táto štúdia pokúsila identifikovať účinné synergické kombinácie kľúčových rastlinných EO zlúčenín z piatich rastlín s insekticídnymi vlastnosťami (t. j. mäta, bazalka svätá, eukalyptus škvrnitý, cesnak sírový a čajovník) proti Aedes aegypti.
Všetky vybrané EO preukázali potenciálnu larvicídnu aktivitu proti Aedes aegypti s 24-hodinovou LC50 v rozmedzí od 0,42 do 163,65 ppm. Najvyššia larvicídna aktivita bola zaznamenaná u EO mäty piepornej (Mp) s hodnotou LC50 0,42 ppm po 24 hodinách, nasledovaného EO cesnaku (As) s hodnotou LC50 16,19 ppm po 24 hodinách (Tabuľka 1).
S výnimkou Ocimum Sainttum, Os EO, všetky ostatné štyri skrínované EO vykazovali zjavné alergické účinky s hodnotami LC50 v rozmedzí od 23,37 do 120,16 ppm počas 24-hodinovej expozície. Thymophilus striata (Cl) EO bol najúčinnejší pri usmrcovaní dospelých jedincov s hodnotou LC50 23,37 ppm v priebehu 24 hodín od expozície, nasledovaný Eucalyptus maculata (Em) s hodnotou LC50 101,91 ppm (Tabuľka 1). Na druhej strane, hodnota LC50 pre Os ešte nebola stanovená, pretože najvyššia úmrtnosť 53 % bola zaznamenaná pri najvyššej dávke (Doplnkový obrázok 3).
Dve hlavné zložky v každom EO boli identifikované a vybrané na základe výsledkov z databázy knižnice NIST, percentuálneho zastúpenia plochy GC chromatogramu a výsledkov MS spektier (Tabuľka 2). V prípade EO As boli hlavnými identifikovanými zlúčeninami diallyldisulfid a diallyltrisulfid; v prípade EO Mp boli hlavnými identifikovanými zlúčeninami karvón a limonén, v prípade EO Em boli hlavnými identifikovanými zlúčeninami eudesmol a eukalyptol; v prípade EO Os boli hlavnými identifikovanými zlúčeninami eugenol a metyleugenol a v prípade EO Cl boli hlavnými identifikovanými zlúčeninami eugenol a α-pinén (Obrázok 1, Doplnkové obrázky 5–8, Doplnková tabuľka 1–5).
Výsledky hmotnostnej spektrometrie hlavných terpenoidov vybraných esenciálnych olejov (A-diallyldisulfid; B-diallyltrisulfid; C-eugenol; D-metyleugenol; E-limonén; F-aromatický ceperón; G-α-pinén; H-cineol; R-eudamol).
Celkovo bolo identifikovaných deväť zlúčenín (diallyldisulfid, diallyltrisulfid, eugenol, metyleugenol, karvón, limonén, eukalyptol, eudesmol, α-pinén) ako účinné zlúčeniny, ktoré sú hlavnými zložkami EO, a boli jednotlivo biologicky testované proti Aedes aegypti v larválnych štádiách. Zlúčenina eudesmol mala najvyššiu larvicídnu aktivitu s hodnotou LC50 2,25 ppm po 24 hodinách expozície. Zistilo sa tiež, že zlúčeniny diallyldisulfid a diallyltrisulfid majú potenciálne larvicídne účinky s priemernými subletálnymi dávkami v rozmedzí 10 – 20 ppm. Mierna larvicídna aktivita bola opäť pozorovaná u zlúčenín eugenol, limonén a eukalyptol s hodnotami LC50 63,35 ppm, 139,29 ppm a 181,33 ppm po 24 hodinách (Tabuľka 3). Avšak ani pri najvyšších dávkach sa nezistil žiadny významný larvicídny potenciál metyl eugenolu a karvónu, preto hodnoty LC50 neboli vypočítané (Tabuľka 3). Syntetický larvicíd Temephos mal priemernú letálnu koncentráciu 0,43 ppm proti Aedes aegypti počas 24 hodín expozície (Tabuľka 3, Doplnková tabuľka 6).
Sedem zlúčenín (diallyldisulfid, diallyltrisulfid, eukalyptol, α-pinén, eudesmol, limonén a karvón) bolo identifikovaných ako hlavné zlúčeniny účinného EO a boli jednotlivo testované proti dospelým komárom rodu Aedes. Podľa regresnej analýzy Probit sa zistilo, že eudesmol má najvyšší potenciál s hodnotou LC50 1,82 ppm, nasledovaný eukalyptolom s hodnotou LC50 17,60 ppm pri 24-hodinovej expozícii. Zvyšných päť testovaných zlúčenín bolo mierne škodlivých pre dospelé jedince s hodnotami LC50 v rozmedzí od 140,79 do 737,01 ppm (Tabuľka 3). Syntetický organofosforový malatión bol menej účinný ako eudesmol a účinnejší ako ostatných šesť zlúčenín s hodnotou LC50 5,44 ppm počas 24-hodinovej expozície (Tabuľka 3, Doplnková tabuľka 6).
Na formuláciu binárnych kombinácií ich dávok LC50 v pomere 1:1 bolo vybraných sedem účinných hlavných zlúčenín a organofosforový tamefosát. Celkovo bolo pripravených a testovaných 28 binárnych kombinácií na ich larvicídnu účinnosť proti Aedes aegypti. Deväť kombinácií bolo synergických, 14 kombinácií bolo antagonistických a päť kombinácií nebolo larvicídnych. Spomedzi synergických kombinácií bola najúčinnejšia kombinácia diallyldisulfidu a temofolu so 100 % úmrtnosťou pozorovanou po 24 hodinách (Tabuľka 4). Podobne zmesi limonénu s diallyldisulfidom a eugenolu s tymetfosom vykazovali dobrý potenciál s pozorovanou úmrtnosťou lariev 98,3 % (Tabuľka 5). Zostávajúce 4 kombinácie, a to eudesmol plus eukalyptol, eudesmol plus limonén, eukalyptol plus alfa-pinén, alfa-pinén plus temefos, tiež vykazovali významnú larvicídnu účinnosť s pozorovanou mierou úmrtnosti presahujúcou 90 %. Očakávaná úmrtnosť sa blíži k 60 – 75 %. (Tabuľka 4). Kombinácia limonénu s α-pinénom alebo eukalyptom však vykazovala antagonistické reakcie. Podobne sa zistilo, že zmesi Temefosu s eugenolom alebo eukalyptom, eudesmolom alebo diallyltrisulfidom majú antagonistické účinky. Podobne aj kombinácia diallyldisulfidu a diallyltrisulfidu a kombinácia ktorejkoľvek z týchto zlúčenín s eudesmolom alebo eugenolom majú antagonistický účinok na larvicíd. Antagonizmus bol hlásený aj pri kombinácii eudesmolu s eugenolom alebo α-pinénom.
Zo všetkých 28 binárnych zmesí testovaných na kyslú aktivitu u dospelých jedincov bolo 7 kombinácií synergických, 6 nemalo žiadny účinok a 15 bolo antagonistických. Zistilo sa, že zmesi eudesmolu s eukalyptom a limonénu s karvónom sú účinnejšie ako iné synergické kombinácie s úmrtnosťou po 24 hodinách 76 %, respektíve 100 % (Tabuľka 5). U malatiónu sa pozoroval synergický účinok so všetkými kombináciami zlúčenín okrem limonénu a diallyltrisulfidu. Na druhej strane sa zistil antagonizmus medzi diallyldisulfidom a diallyltrisulfidom a kombináciou ktoréhokoľvek z nich s eukalyptom, eukalyptolom, karvónom alebo limonénom. Podobne kombinácie α-pinénu s eudesmolom alebo limonénom, eukalyptolu s karvónom alebo limonénom a limonénu s eudesmolom alebo malatiónom vykazovali antagonistické larvicídne účinky. Pri zostávajúcich šiestich kombináciách nebol zistený žiadny významný rozdiel medzi očakávanou a pozorovanou úmrtnosťou (Tabuľka 5).
Na základe synergických účinkov a subletálnych dávok bola nakoniec vybraná a ďalej testovaná ich larvicídna toxicita proti veľkému počtu komárov druhu Aedes aegypti. Výsledky ukázali, že pozorovaná úmrtnosť lariev pri použití binárnych kombinácií eugenol-limonén, diallyldisulfid-limonén a diallyldisulfid-timefos bola 100 %, zatiaľ čo očakávaná úmrtnosť lariev bola 76,48 %, 72,16 % a 63,4 % (Tabuľka 6). Kombinácia limonénu a eudesmolu bola relatívne menej účinná, pričom počas 24-hodinového expozičného obdobia bola pozorovaná úmrtnosť lariev 88 % (Tabuľka 6). Stručne povedané, štyri vybrané binárne kombinácie preukázali synergické larvicídne účinky aj proti Aedes aegypti pri aplikácii vo veľkom meradle (Tabuľka 6).
Pre adultocídny biologický test na kontrolu veľkých populácií dospelých jedincov Aedes aegypti boli vybrané tri synergické kombinácie. Pri výbere kombinácií na testovanie na veľkých hmyzích kolóniách sme sa najprv zamerali na dve najlepšie synergické terpénové kombinácie, a to karvón plus limonén a eukalyptol plus eudesmol. Po druhé, najlepšia synergická kombinácia bola vybraná z kombinácie syntetického organofosfátu malatiónu a terpenoidov. Domnievame sa, že kombinácia malatiónu a eudesmolu je najlepšou kombináciou na testovanie na veľkých hmyzích kolóniách kvôli najvyššej pozorovanej úmrtnosti a veľmi nízkym hodnotám LC50 kandidátskych zložiek. Malatión vykazuje synergizmus v kombinácii s α-pinénom, diallyldisulfidom, eukalyptom, karvónom a eudesmolom. Ak sa však pozrieme na hodnoty LC50, eudesmol má najnižšiu hodnotu (2,25 ppm). Vypočítané hodnoty LC50 malatiónu, α-pinénu, diallyldisulfidu, eukalyptolu a karvónu boli 5,4, 716,55, 166,02, 17,6 a 140,79 ppm. Tieto hodnoty naznačujú, že kombinácia malatiónu a eudesmolu je optimálna kombinácia z hľadiska dávkovania. Výsledky ukázali, že kombinácie karvónu plus limonénu a eudesmolu plus malatión mali 100 % pozorovanú úmrtnosť v porovnaní s očakávanou úmrtnosťou 61 % až 65 %. Ďalšia kombinácia, eudesmol plus eukalyptol, vykazovala úmrtnosť 78,66 % po 24 hodinách expozície v porovnaní s očakávanou úmrtnosťou 60 %. Všetky tri vybrané kombinácie preukázali synergické účinky aj pri aplikácii vo veľkom meradle proti dospelým Aedes aegypti (Tabuľka 6).
V tejto štúdii vybrané rastlinné esenciálne oleje (EO), ako napríklad Mp, As, Os, Em a Cl, preukázali sľubné letálne účinky na larválne a dospelé štádiá Aedes aegypti. Mp EO mal najvyššiu larvicídnu aktivitu s hodnotou LC50 0,42 ppm, nasledovaný As, Os a Em EO s hodnotou LC50 menej ako 50 ppm po 24 hodinách. Tieto výsledky sú v súlade s predchádzajúcimi štúdiami komárov a iných dvojkrídlových múch 10,11,12,13,14. Hoci larvicídna účinnosť Cl je nižšia ako u iných esenciálnych olejov s hodnotou LC50 163,65 ppm po 24 hodinách, jeho dospelý potenciál je najvyšší s hodnotou LC50 23,37 ppm po 24 hodinách. Mp, As a Em EO tiež preukázali dobrý alergicídny potenciál s hodnotami LC50 v rozmedzí 100 – 120 ppm pri 24 hodinách expozície, ale boli relatívne nižšie ako ich larvicídna účinnosť. Na druhej strane, EO Os preukázal zanedbateľný alergický účinok aj pri najvyššej terapeutickej dávke. Výsledky teda naznačujú, že toxicita etylénoxidu pre rastliny sa môže líšiť v závislosti od vývojového štádia komárov15. Závisí tiež od rýchlosti prenikania EO do tela hmyzu, ich interakcie so špecifickými cieľovými enzýmami a detoxikačnej kapacity komára v každom vývojovom štádiu16. Veľké množstvo štúdií ukázalo, že hlavná zložka je dôležitým faktorom biologickej aktivity etylénoxidu, pretože tvorí väčšinu celkových zlúčenín3,12,17,18. Preto sme v každom EO zvážili dve hlavné zlúčeniny. Na základe výsledkov GC-MS boli ako hlavné zlúčeniny EO As identifikované diallyldisulfid a diallyltrisulfid, čo je v súlade s predchádzajúcimi správami19,20,21. Hoci predchádzajúce správy naznačovali, že mentol bol jednou z jeho hlavných zlúčenín, karvón a limonén boli opäť identifikované ako hlavné zlúčeniny Mp EO22,23. Profil zloženia Os EO ukázal, že hlavnými zlúčeninami sú eugenol a metyl eugenol, čo je podobné zisteniam skorších výskumníkov16,24. Eukalyptol a eukalyptol boli uvedené ako hlavné zlúčeniny prítomné v oleji z listov Em, čo je v súlade so zisteniami niektorých výskumníkov25,26, ale v rozpore so zisteniami Olalade a kol.27. Dominancia cineolu a α-pinénu bola pozorovaná v éterickom oleji z Melaleuca, čo je podobné predchádzajúcim štúdiám28,29. Boli hlásené a pozorované aj v tejto štúdii vnútrodruhové rozdiely v zložení a koncentrácii éterických olejov extrahovaných z rovnakých druhov rastlín na rôznych miestach, ktoré sú ovplyvnené geografickými podmienkami rastu rastlín, časom zberu, vývojovým štádiom alebo vekom rastliny, výskytom chemotypov atď.22,30,31,32. Kľúčové identifikované zlúčeniny boli potom zakúpené a testované na ich larvicídne účinky a účinky na dospelé komáre Aedes aegypti. Výsledky ukázali, že larvicídna aktivita diallyldisulfidu bola porovnateľná s aktivitou surového EO As. Aktivita diallyltrisulfidu je však vyššia ako u EO As. Tieto výsledky sú podobné výsledkom, ktoré získali Kimbaris a kol. 33 na Culex philippines. Tieto dve zlúčeniny však nepreukázali dobrú autocídnu aktivitu proti cieľovým komárom, čo je v súlade s výsledkami Plata-Rueda a kol. 34 na Tenebrio molitor. Os EO je účinný proti larválnemu štádiu Aedes aegypti, ale nie proti dospelému štádiu. Bolo zistené, že larvicídna aktivita hlavných jednotlivých zlúčenín je nižšia ako u surového Os EO. To naznačuje úlohu iných zlúčenín a ich interakcie v surovom etylénoxide. Samotný metyleugenol má zanedbateľnú aktivitu, zatiaľ čo eugenol samotný má miernu larvicídnu aktivitu. Tento záver na jednej strane potvrdzuje 35, 36 a na druhej strane je v rozpore so závermi skorších výskumníkov 37, 38. Rozdiely vo funkčných skupinách eugenolu a metyleugenolu môžu viesť k rôznym toxicitám pre ten istý cieľový hmyz39. Zistilo sa, že limonén má miernu larvicídnu aktivitu, zatiaľ čo účinok karvónu bol nevýznamný. Podobne relatívne nízka toxicita limonénu pre dospelý hmyz a vysoká toxicita karvónu podporujú výsledky niektorých predchádzajúcich štúdií40, ale protirečia iným41. Prítomnosť dvojitých väzieb v intracyklických aj exocyklických polohách môže zvýšiť výhody týchto zlúčenín ako larvicídov3,41, zatiaľ čo karvón, čo je ketón s nenasýtenými alfa a beta atómami uhlíka, môže vykazovať vyšší potenciál toxicity u dospelých42. Individuálne charakteristiky limonénu a karvónu sú však oveľa nižšie ako celkový EO Mp (Tabuľka 1, Tabuľka 3). Spomedzi testovaných terpenoidov sa zistilo, že eudesmol má najväčšiu larvicídnu a dospelú aktivitu s hodnotou LC50 pod 2,5 ppm, čo z neho robí sľubnú zlúčeninu na kontrolu komárov rodu Aedes. Jeho účinnosť je lepšia ako účinnosť celého EO Em, hoci to nie je v súlade so zisteniami Chenga a kol.40. Eudesmol je seskviterpén s dvoma izoprénovými jednotkami, ktorý je menej prchavý ako okysličené monoterpény, ako je eukalyptus, a preto má väčší potenciál ako pesticíd. Samotný eukalyptol má väčšiu aktivitu v dospelosti ako v larvicídnom účinku a výsledky skorších štúdií to podporujú aj vyvracajú37,43,44. Samotná aktivita je takmer porovnateľná s aktivitou celého EO Cl. Ďalší bicyklický monoterpén, α-pinén, má menší účinok v dospelosti na Aedes aegypti ako larvicídny účinok, čo je opak účinku celého EO Cl. Celková insekticídna aktivita terpenoidov je ovplyvnená ich lipofilitou, prchavosťou, rozvetvením uhlíka, projekčnou plochou, povrchovou plochou, funkčnými skupinami a ich polohami45,46. Tieto zlúčeniny môžu pôsobiť tak, že ničia bunkové nahromadenia, blokujú respiračnú aktivitu, prerušujú prenos nervových impulzov atď.47 Zistilo sa, že syntetický organofosfát Temephos má najvyššiu larvicídnu aktivitu s hodnotou LC50 0,43 ppm, čo je v súlade s Lekovými údajmi - Utala48. Účinnosť syntetického organofosfátového malatiónu na dospelých jedincov bola hlásená na úrovni 5,44 ppm. Hoci tieto dva organofosfáty preukázali priaznivé reakcie proti laboratórnym kmeňom Aedes aegypti, rezistencia komárov voči týmto zlúčeninám bola hlásená v rôznych častiach sveta49. Neboli však nájdené žiadne podobné správy o vývoji rezistencie voči rastlinným liekom50. Preto sa rastlinné prípravky považujú za potenciálne alternatívy k chemickým pesticídom v programoch kontroly vektorov.
Larvicídny účinok bol testovaný na 28 binárnych kombináciách (1:1) pripravených z účinných terpenoidov a terpenoidov s tymetfosom a 9 kombinácií sa ukázalo ako synergických, 14 antagonistických a 5 antagonistických. Žiadny účinok. Na druhej strane, v biotestu účinnosti u dospelých jedincov sa zistilo, že 7 kombinácií je synergických, 15 kombinácií antagonistických a 6 kombinácií nemalo žiadny účinok. Dôvod, prečo určité kombinácie vyvolávajú synergický účinok, môže byť spôsobený súčasnou interakciou kandidátskych zlúčenín v rôznych dôležitých dráhach alebo postupnou inhibíciou rôznych kľúčových enzýmov konkrétnej biologickej dráhy51. Zistilo sa, že kombinácia limonénu s diallyldisulfidom, eukalyptom alebo eugenolom je synergická v aplikáciách v malom aj veľkom meradle (Tabuľka 6), zatiaľ čo jeho kombinácia s eukalyptom alebo α-pinénom má antagonistické účinky na larvy. V priemere sa limonén javí ako dobrý synergista, pravdepodobne kvôli prítomnosti metylových skupín, dobrému prenikaniu do stratum corneum a odlišnému mechanizmu účinku52,53. Už skôr sa uvádza, že limonén môže spôsobiť toxické účinky prenikaním cez kutikuly hmyzu (kontaktná toxicita), ovplyvňovaním tráviaceho systému (antifeedant) alebo ovplyvňovaním dýchacieho systému (fumigačná aktivita), 54 zatiaľ čo fenylpropanoidy, ako je eugenol, môžu ovplyvňovať metabolické enzýmy 55. Preto kombinácie zlúčenín s rôznymi mechanizmami účinku môžu zvýšiť celkový letálny účinok zmesi. Zistilo sa, že eukalyptol je synergický s diallyldisulfidom, eukalyptom alebo α-pinénom, ale iné kombinácie s inými zlúčeninami boli buď nelarvicídne, alebo antagonistické. Skoršie štúdie ukázali, že eukalyptol má inhibičnú aktivitu na acetylcholínesterázu (AChE), ako aj na oktaamínové a GABA receptory 56. Keďže cyklické monoterpény, eukalyptol, eugenol atď. môžu mať rovnaký mechanizmus účinku ako ich neurotoxická aktivita, 57 čím sa minimalizujú ich kombinované účinky prostredníctvom vzájomnej inhibície. Podobne sa zistilo, že kombinácia Temefosu s diallyldisulfidom, α-pinénom a limonénom je synergická, čo podporuje predchádzajúce správy o synergickom účinku medzi rastlinnými produktmi a syntetickými organofosfátmi58.
Zistilo sa, že kombinácia eudesmolu a eukalyptolu má synergický účinok na larválne a dospelé štádiá Aedes aegypti, pravdepodobne kvôli ich odlišným mechanizmom účinku v dôsledku ich odlišných chemických štruktúr. Eudesmol (seskviterpén) môže ovplyvniť dýchací systém 59 a eukalyptol (monoterpén) môže ovplyvniť acetylcholínesterázu 60. Súčasné vystavenie zložiek dvom alebo viacerým cieľovým miestam môže zvýšiť celkový letálny účinok kombinácie. V biologických testoch na dospelých látkach sa zistilo, že malatión je synergický s karvónom alebo eukalyptolom alebo eukalyptolom alebo diallyldisulfidom alebo α-pinénom, čo naznačuje, že je synergický s pridaním limonénu a di-1,2-disulfidu. Dobrými synergickými kandidátmi na alergiu pre celé portfólio terpénových zlúčenín, s výnimkou allyltrisulfidu. Thangam a Kathiresan61 tiež uviedli podobné výsledky synergického účinku malatiónu s bylinnými extraktmi. Táto synergická reakcia môže byť spôsobená kombinovanými toxickými účinkami malatiónu a fytochemikálií na enzýmy detoxikačné pre hmyz. Organofosfáty, ako je malatión, vo všeobecnosti pôsobia inhibíciou esteráz cytochrómu P450 a monooxygenáz62,63,64. Preto kombinácia malatiónu s týmito mechanizmami účinku a terpénov s rôznymi mechanizmami účinku môže zvýšiť celkový letálny účinok na komáre.
Na druhej strane, antagonizmus naznačuje, že vybrané zlúčeniny sú v kombinácii menej aktívne ako každá zlúčenina samostatne. Dôvodom antagonizmu v niektorých kombináciách môže byť to, že jedna zlúčenina modifikuje správanie druhej zlúčeniny zmenou rýchlosti absorpcie, distribúcie, metabolizmu alebo vylučovania. Skorí výskumníci to považovali za príčinu antagonizmu v kombináciách liekov. Molekuly Možný mechanizmus 65. Podobne, možné príčiny antagonizmu môžu súvisieť s podobnými mechanizmami účinku, konkurenciou zložiek o rovnaký receptor alebo cieľové miesto. V niektorých prípadoch môže dôjsť aj k nekompetitívnej inhibícii cieľového proteínu. V tejto štúdii dve organosírové zlúčeniny, diallyldisulfid a diallyltrisulfid, vykazovali antagonistické účinky, pravdepodobne v dôsledku konkurencie o rovnaké cieľové miesto. Podobne tieto dve zlúčeniny síry vykazovali antagonistické účinky a nemali žiadny účinok v kombinácii s eudesmolom a α-pinénom. Eudesmol a alfa-pinén majú cyklickú povahu, zatiaľ čo diallyldisulfid a diallyltrisulfid majú alifatickú povahu. Na základe chemickej štruktúry by kombinácia týchto zlúčenín mala zvýšiť celkovú letálnu aktivitu, pretože ich cieľové miesta sú zvyčajne odlišné34,47, ale experimentálne sme zistili antagonizmus, ktorý môže byť spôsobený úlohou týchto zlúčenín v niektorých neznámych organizmoch in vivo. systémoch v dôsledku interakcie. Podobne kombinácia cineolu a α-pinénu vyvolala antagonistické reakcie, hoci výskumníci predtým uviedli, že tieto dve zlúčeniny majú odlišné ciele účinku47,60. Keďže obe zlúčeniny sú cyklické monoterpény, môžu existovať niektoré spoločné cieľové miesta, ktoré môžu súťažiť o väzbu a ovplyvňovať celkovú toxicitu študovaných kombinatorických párov.
Na základe hodnôt LC50 a pozorovanej úmrtnosti boli vybrané dve najlepšie synergické kombinácie terpénov, a to páry karvón + limonén a eukalyptol + eudesmol, ako aj syntetický organofosforový malatión s terpénmi. Optimálna synergická kombinácia zlúčenín malatión + eudesmol bola testovaná v biologickej skúške s insekticídmi na dospelých jedincoch. Cieľom je osloviť veľké kolónie hmyzu, aby sa potvrdilo, či tieto účinné kombinácie dokážu pôsobiť proti veľkému počtu jedincov na relatívne veľkých expozičných plochách. Všetky tieto kombinácie vykazujú synergický účinok proti veľkým rojom hmyzu. Podobné výsledky sa získali pre optimálnu synergickú larvicídnu kombináciu testovanú proti veľkým populáciám lariev Aedes aegypti. Dá sa teda povedať, že účinná synergická larvicídna a adulticídna kombinácia rastlinných zlúčenín EO je silným kandidátom proti existujúcim syntetickým chemikáliám a možno ju ďalej použiť na kontrolu populácií Aedes aegypti. Podobne možno účinné kombinácie syntetických larvicídov alebo adulticídov s terpénmi použiť aj na zníženie dávok tymetfosu alebo malatiónu podávaných komárom. Tieto silné synergické kombinácie môžu poskytnúť riešenia pre budúce štúdie vývoja rezistencie na liečivá u komárov Aedes.
Vajíčka Aedes aegypti boli zozbierané z Regionálneho centra pre lekársky výskum v Dibrugarhu, Indickej rady pre lekársky výskum, a uchovávané pri kontrolovanej teplote (28 ± 1 °C) a vlhkosti (85 ± 5 %) na Katedre zoológie Gauhati University za nasledujúcich podmienok: Arivoli a kol. boli opísané. Po vyliahnutí boli larvy kŕmené larválnym krmivom (prášok zo psích sušienok a droždie v pomere 3:1) a dospelé jedince boli kŕmené 10 % roztokom glukózy. Od 3. dňa po vyliahnutí sa dospelým samiciam komárov umožnilo cicať krv albínskych potkanov. Filtračný papier namočte do vody v pohári a umiestnite ho do klietky na kladenie vajec.
Vybrané vzorky rastlín, a to listy eukalyptu (Myrtaceae), bazalka svätá (Lamiaceae), mäta (Lamiaceae), čajovník (Myrtaceae) a cibuľky cesnaku (Amaryllidaceae). Zozbierané z Guwahati a identifikované katedrou botaniky Gauhati University. Zozbierané vzorky rastlín (500 g) boli podrobené hydrodestilácii pomocou Clevengerovho prístroja počas 6 hodín. Extrahovaný EO bol zozbieraný do čistých sklenených fľaštičiek a uskladnený pri teplote 4 °C na ďalšie štúdium.
Larvicídna toxicita bola študovaná s použitím mierne upravených štandardných postupov Svetovej zdravotníckej organizácie 67. Ako emulgátor sa použil DMSO. Každá koncentrácia EO bola spočiatku testovaná pri 100 a 1000 ppm, pričom v každom opakovaní bolo vystavených 20 lariev. Na základe výsledkov sa použil koncentračný rozsah a úmrtnosť sa zaznamenávala od 1 hodiny do 6 hodín (v 1-hodinových intervaloch) a 24 hodín, 48 hodín a 72 hodín po ošetrení. Subletálne koncentrácie (LC50) boli stanovené po 24, 48 a 72 hodinách expozície. Každá koncentrácia bola testovaná trojmo spolu s jednou negatívnou kontrolou (iba voda) a jednou pozitívnou kontrolou (voda ošetrená DMSO). Ak dôjde k zakukľovaniu a uhynie viac ako 10 % lariev kontrolnej skupiny, experiment sa opakuje. Ak je úmrtnosť v kontrolnej skupine medzi 5 – 10 %, použite Abbottov korekčný vzorec 68.
Metóda opísaná Ramarom a kol.69 bola použitá na biologický test proti dospelým komárom Aedes aegypti s použitím acetónu ako rozpúšťadla. Každý EO bol najprv testovaný proti dospelým komárom Aedes aegypti v koncentráciách 100 a 1000 ppm. 2 ml každého pripraveného roztoku sa nanesie na Whatmanovo číslo. 1 kus filtračného papiera (rozmery 12 x 15 cm2) a acetón sa nechá odparovať 10 minút. Ako kontrola sa použil filtračný papier ošetrený iba 2 ml acetónu. Po odparení acetónu sa ošetrený filtračný papier a kontrolný filtračný papier umiestnia do valcovej skúmavky (hĺbka 10 cm). Desať 3 až 4-dňových komárov, ktoré sa nekŕmia krvou, sa prenesie do troch opakovaní s každou koncentráciou. Na základe výsledkov predbežných testov sa testujú rôzne koncentrácie vybraných olejov. Úmrtnosť sa zaznamenáva 1 hodinu, 2 hodiny, 3 hodiny, 4 hodiny, 5 hodín, 6 hodín, 24 hodín, 48 hodín a 72 hodín po vypustení komára. Vypočítajte hodnoty LC50 pre expozičné časy 24 hodín, 48 hodín a 72 hodín. Ak úmrtnosť kontrolnej skupiny presiahne 20 %, zopakujte celý test. Podobne, ak je úmrtnosť v kontrolnej skupine vyššia ako 5 %, upravte výsledky pre ošetrené vzorky pomocou Abbottovho vzorca68.
Na analýzu zložiek vybraných esenciálnych olejov sa použila plynová chromatografia (Agilent 7890A) a hmotnostná spektrometria (Accu TOF GCv, Jeol). GC bol vybavený FID detektorom a kapilárnou kolónou (HP5-MS). Nosným plynom bolo hélium, prietok bol 1 ml/min. Program GC nastavuje pomer cesnaku siateho (Allium sativum) na 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M a Ocimum Sainttum na 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280, pre mätu 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, pre eukalyptus 20,60-1M-10-200-3M-30-280 a pre červenú cesnaku (For Thousand Layer) na 10:60-1M-8-220-5M-8-270-3M.
Hlavné zlúčeniny každého EO boli identifikované na základe percentuálneho zastúpenia plochy vypočítaného z výsledkov GC chromatogramu a hmotnostnej spektrometrie (s odkazom na databázu štandardov NIST 70).
Dve hlavné zlúčeniny v každom EO boli vybrané na základe výsledkov GC-MS a zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich v čistote 98 – 99 % pre ďalšie biologické testy. Zlúčeniny boli testované na larvicídnu a dospelú účinnosť proti Aedes aegypti, ako je opísané vyššie. Najbežnejšie používané syntetické larvicídy tamefosát (Sigma Aldrich) a liečivo pre dospelých malatión (Sigma Aldrich) boli analyzované s cieľom porovnať ich účinnosť s vybranými zlúčeninami EO podľa rovnakého postupu.
Binárne zmesi vybraných terpénových zlúčenín a terpénových zlúčenín plus komerčných organofosfátov (tilefos a malatión) boli pripravené zmiešaním dávky LC50 každej kandidátskej zlúčeniny v pomere 1:1. Pripravené kombinácie boli testované na larválnych a dospelých štádiách Aedes aegypti, ako je opísané vyššie. Každý biologický test bol vykonaný v troch opakovaniach pre každú kombináciu a v troch opakovaniach pre jednotlivé zlúčeniny prítomné v každej kombinácii. Úhyn cieľového hmyzu bol zaznamenaný po 24 hodinách. Vypočítajte očakávanú mieru úmrtnosti pre binárnu zmes pomocou nasledujúceho vzorca.
kde E = očakávaná úmrtnosť komárov Aedes aegypti v reakcii na binárnu kombináciu, t. j. spojenie (A + B).
Účinok každej binárnej zmesi bol označený ako synergický, antagonistický alebo žiadny účinok na základe hodnoty χ2 vypočítanej metódou opísanou Pavlou52. Hodnotu χ2 pre každú kombináciu vypočítajte pomocou nasledujúceho vzorca.
Účinok kombinácie bol definovaný ako synergický, keď vypočítaná hodnota χ2 bola väčšia ako tabuľková hodnota pre zodpovedajúce stupne voľnosti (95 % interval spoľahlivosti) a ak sa zistilo, že pozorovaná úmrtnosť presiahla očakávanú úmrtnosť. Podobne, ak vypočítaná hodnota χ2 pre akúkoľvek kombináciu presiahne tabuľkovú hodnotu s niektorými stupňami voľnosti, ale pozorovaná úmrtnosť je nižšia ako očakávaná úmrtnosť, liečba sa považuje za antagonistickú. A ak je v akejkoľvek kombinácii vypočítaná hodnota χ2 menšia ako tabuľková hodnota v zodpovedajúcich stupňoch voľnosti, kombinácia sa považuje za neúčinnú.
Na testovanie proti veľkému počtu hmyzu boli vybrané tri až štyri potenciálne synergické kombinácie (100 lariev a 50 dospelých jedincov s larvicídnou a dospelou aktivitou). Dospelé jedince postupujú ako je uvedené vyššie. Spolu so zmesami boli testované aj jednotlivé zlúčeniny prítomné vo vybraných zmesiach na rovnakom počte lariev a dospelých jedincov Aedes aegypti. Pomer kombinácií je jedna časť dávky LC50 jednej kandidátskej zlúčeniny a časť dávky LC50 druhej zložky. V biotestu aktivity na dospelých jedincov boli vybrané zlúčeniny rozpustené v acetóne, rozpúšťadle, a nanesené na filtračný papier zabalený vo valcovitej plastovej nádobe s objemom 1300 cm3. Acetón sa odparoval 10 minút a dospelé jedince sa uvoľnili. Podobne v biotestu larvicídnej aktivity boli dávky kandidátskych zlúčenín LC50 najprv rozpustené v rovnakých objemoch DMSO a potom zmiešané s 1 litrom vody uloženej v plastových nádobách s objemom 1300 cm3 a larvy sa uvoľnili.
Pravdepodobnostná analýza 71 zaznamenaných údajov o úmrtnosti bola vykonaná pomocou softvéru SPSS (verzia 16) a Minitab na výpočet hodnôt LC50.
Čas uverejnenia: 1. júla 2024