Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Na dosiahnutie najlepších výsledkov vám odporúčame použiť novšiu verziu prehliadača (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlu alebo JavaScriptu.
Objav a prospešné využitie prírodných produktov môže pomôcť zlepšiť ľudský život.Chemikálie inhibujúce rast rastlín sa široko používajú ako herbicídy na ničenie buriny.Vzhľadom na potrebu použitia rôznych typov herbicídov je potrebné identifikovať zlúčeniny s novými mechanizmami účinku.V tejto štúdii sme objavili novú N-alkoxypyrolovú zlúčeninu, kumamonamid, zo Streptomyces werraensis MK493-CF1 a zaviedli sme kompletný proces syntézy.Prostredníctvom testov biologickej aktivity sme zistili, že kyselina urs-monoamová je syntetický medziprodukt urs-monoamidu a potenciálnyinhibítor rastu rastlín.Okrem toho sme vyvinuli rôzne deriváty kyseliny urbenónovej, vrátane urbenyloxy derivátu (UDA), ktorý má vysokú herbicídnu aktivitu bez negatívneho ovplyvnenia rastu buniek HeLa.Tiež sme zistili, že deriváty kyseliny urmotónovej narúšajú mikrotubuly rastlín;okrem toho KAND ovplyvňuje aktínové vlákna a vyvoláva bunkovú smrť;Tieto mnohostranné účinky sa líšia od účinkov známych inhibítorov mikrotubulov a naznačujú nový mechanizmus účinku kyseliny ursonovej, čo predstavuje dôležitú výhodu pri vývoji nových herbicídov.
Objavovanie a praktická aplikácia prospešných prírodných produktov a ich derivátov je prostriedkom na zlepšenie kvality ľudského života.Sekundárne metabolity produkované mikroorganizmami, rastlinami a hmyzom viedli k veľkému pokroku v medicíne a poľnohospodárstve.Mnohé antibiotiká a lieky proti leukémii boli vyvinuté z prírodných produktov.Okrem toho rôzne druhypesticídyZ týchto prírodných produktov sa získavajú fungicídy a herbicídy na použitie v poľnohospodárstve.Najmä herbicídy na ničenie buriny sú dôležitými nástrojmi na zvýšenie výnosov plodín v modernom poľnohospodárstve a rôzne typy zlúčenín sa už používajú komerčne.Za typické ciele herbicídov sa považujú viaceré bunkové procesy v rastlinách, ako je fotosyntéza, metabolizmus aminokyselín, syntéza bunkovej steny, regulácia mitózy, signalizácia fytohormónov alebo syntéza proteínov.Zlúčeniny, ktoré inhibujú funkciu mikrotubulov, sú bežnou triedou herbicídov, ktoré ovplyvňujú rast rastlín ovplyvňovaním mitotickej regulácie2.
Mikrotubuly sú súčasťou cytoskeletu a sú široko konzervované v eukaryotických bunkách.Tubulínový heterodimér pozostáva z α-tubulínu a β-tubulínu tvoriacich lineárne mikrotubulové protofilamenty, pričom 13 protofilamentov tvorí valcovú štruktúru.Mikrotubuly hrajú v rastlinných bunkách viaceré úlohy, vrátane určovania tvaru bunky, bunkového delenia a vnútrobunkového transportu3,4.Rastlinné bunky obsahujú mikrotubuly pod medzifázovou plazmatickou membránou a predpokladá sa, že tieto takzvané kortikálne mikrotubuly riadia organizáciu celulózových mikrofibríl prostredníctvom regulácie komplexov celulózy syntázy4,5.Kortikálne mikrotubuly koreňových epidermálnych buniek, prítomné v zóne rýchleho predlžovania špičky koreňa, sú umiestnené laterálne a celulózové mikrovlákna tieto mikrotubuly sledujú a obmedzujú smer expanzie buniek, čím podporujú anizotropné predlžovanie buniek.Preto funkcia mikrotubulov úzko súvisí s morfológiou rastlín.Aminokyselinové substitúcie v génoch kódujúcich tubulín spôsobujú zošikmenie kortikálnych mikrotubulových polí a ľavo- alebo pravostranný rast v Arabidopsis 6,7.Podobne mutácie v proteínoch spojených s mikrotubulami, ktoré regulujú dynamiku mikrotubulov, môžu tiež viesť k skreslenému rastu koreňov8, 9, 10, 11, 12, 13.Ošetrenie herbicídmi narušujúcimi mikrotubuly, ako je disopyramid, tiež známy ako pretilachlor, navyše spôsobuje ľavostranný šikmý rast koreňov14.Tieto údaje naznačujú, že presná regulácia funkcie mikrotubulov je rozhodujúca pre určenie smeru rastu rastlín.
Boli objavené rôzne typy inhibítorov mikrotubulov a tieto lieky významne prispeli k výskumu cytoskeletu, ako aj k poľnohospodárstvu a medicíne2.Najmä oryzalín, dinitroanilínové zlúčeniny, dizopyramid, zlúčeniny príbuzné benzamidu a ich analógy môžu inhibovať funkciu mikrotubulov a tým inhibovať rast rastlín.Preto sú široko používané ako herbicídy.Keďže sú však mikrotubuly dôležitou zložkou rastlinných a živočíšnych buniek, väčšina inhibítorov mikrotubulov je cytotoxická pre oba typy buniek.Preto, napriek ich uznávanej užitočnosti ako herbicídov, sa na praktické účely používa obmedzený počet antimikrotubulárnych činidiel.
Streptomyces je rod z čeľade Streptomyces, ktorý zahŕňa aeróbne, grampozitívne, vláknité baktérie a je všeobecne známy svojou schopnosťou produkovať široké spektrum sekundárnych metabolitov.Preto sa považuje za jeden z najdôležitejších zdrojov nových biologicky aktívnych prírodných produktov.V súčasnej štúdii sme objavili novú zlúčeninu s názvom kumamonamid, ktorá bola izolovaná zo Streptomyces werraensis MK493-CF1 a S. werraensis ISP 5486. Pomocou spektrálnej analýzy a úplnej spektrálnej analýzy bola charakterizovaná štruktúra kumamonamidu a jeho jedinečný N-alkoxypyrolový skelet bola stanovená.syntéza.Zistilo sa, že kyselina ursmonová, syntetický medziprodukt ursmonoamidu a jeho derivátov, inhibuje rast a klíčenie populárnej modelovej rastliny Arabidopsis thaliana.V štúdii vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou sme zistili, že zlúčenina s C9 modifikovaným na kyselinu ursonovú, nazývaná nonyloxyderivát kyseliny ursonovej (KAND), výrazne zvyšuje inhibičný účinok na rast a klíčenie.Najmä novoobjavený inhibítor rastu rastlín ovplyvnil aj rast tabaku a pečeňovky a nebol cytotoxický pre baktérie alebo bunky HeLa.Okrem toho niektoré deriváty kyseliny urmotónovej indukujú deformovaný koreňový fenotyp, čo znamená, že tieto deriváty priamo alebo nepriamo ovplyvňujú mikrotubuly.V súlade s touto myšlienkou naše pozorovania mikrotubulov značených buď imunohistochemicky alebo fluorescenčnými proteínmi naznačujú, že ošetrenie KAND depolymerizuje mikrotubuly.Okrem toho ošetrenie derivátmi kyseliny kumamotónovej narušilo aktínové mikrofilamenty.Tak sme objavili nový inhibítor rastu rastlín, ktorého jedinečný mechanizmus účinku zahŕňa deštrukciu cytoskeletu.
Kmeň MK493-CF1 bol izolovaný z pôdy v Shinagawa-ku, Tokio.Kmeň MK493-CF1 vytvoril dobre rozvetvené stromálne mycélium.Bola určená čiastočná sekvencia 16S ribozomálneho RNA génu (1422 bp).Tento kmeň je veľmi podobný S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typický kmeň, 99,93 %).Na základe tohto výsledku sa určilo, že tento kmeň úzko súvisí s typovým kmeňom S. werraensis.Preto sme tento kmeň predbežne nazvali S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T tiež produkuje rovnaké bioaktívne zlúčeniny.Keďže skorý výskum získavania prírodných produktov z tohto mikroorganizmu bol malý, uskutočnil sa ďalší chemický výskum.Po kultivácii S. werraensis MK493-CF1 na jačmennom médiu fermentáciou v tuhom stave pri 30 °C počas 14 dní sa médium extrahovalo 50 % EtOH.60 ml vzorky sa vysušilo, čím sa získalo 59,5 mg surového extraktu.Surový extrakt sa podrobil HPLC s reverznou fázou, čím sa získal N-metoxy-lH-pyrol-2-karboxamid (1, nazvaný kumamonamid, 36,0 mg).Celkové množstvo zlúčeniny 1 je približne 60 % surového extraktu.Preto sme sa rozhodli podrobne preštudovať vlastnosti kumamotoamidu 1.
Kumamonamid 1 je biely amorfný prášok a hmotnostná spektrometria s vysokým rozlíšením (HRESIMS) potvrdzuje C6H8N2O2 (obr. 1).C2-substituovaný pyrolový fragment tejto zlúčeniny sa vyznačuje 5H 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), 5H 6,78 (1H, d, J = 2,5, 5H v 1H NMR spektre: 4,5 Hz , H-5) a 5H 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6) a13C NMR spektrum ukazuje prítomnosť štyroch sp2 uhlíkových atómov.Prítomnosť amidovej skupiny v polohe C2 bola hodnotená pomocou HMBC korelácie z protónu C-3 k amidovému karbonylovému uhlíku pri 8C 161,1.Okrem toho 1H a13C NMR píky pri 5H 4,10 (3H, S) a 5C 68,3 indikujú prítomnosť N-metoxy skupín v molekule.Hoci správna poloha metoxyskupiny ešte nebola stanovená pomocou spektroskopickej analýzy, ako je vylepšená diferenčná spektroskopia a skratka jadrovej Overhauserovej (NOEDF), N-metoxy-lH-pyrol-2-karboxamid sa stal prvou kandidátskou zlúčeninou.
Na určenie správnej štruktúry zlúčeniny 1 sa uskutočnila celková syntéza (obr. 2a).Spracovanie komerčne dostupného 2-aminopyridínu 2 s m-CPBA viedlo k zodpovedajúcemu N-oxidu 3 v kvantitatívnom výťažku.Po 2-aminoazidácii zlúčeniny 2 sa uskutočnila cyklokondenzačná reakcia opísaná Abramovičom v benzéne pri 90 °C, čím sa získal požadovaný l-hydroxy-lH-pyrol-2-karbonitril 5 v gramoch.Rýchlosť 60% (dva stupne).15,16.Metyláciou a hydrolýzou zlúčeniny 4 sa potom získa 1-metoxy-lH-pyrol-2-karboxylová kyselina (nazývaná „kyselina kumotónová“, 6) v dobrom výťažku (70 %, dva kroky).Nakoniec amidáciou cez chlorid kyseliny medziproduktu 6 s použitím vodného amoniaku sa získal Kumamoto amid 1 v 98 % výťažku.Všetky spektrálne údaje syntetizovaného 1 boli podobné ako izolovaný 1, takže bola určená štruktúra 1;
Všeobecná syntéza a analýza biologickej aktivity urbenamidu a kyseliny urbenovej.(a) Celková syntéza Kumamoto amidu.(b) Sedem dní staré sadenice divokého typu Arabidopsis Columbia (Col) sa pestovali na platniach Murashige a Skoog (MS) obsahujúcich kumamonamid 6 alebo kumamonamid 1 v uvedených koncentráciách.Mierka = 1 cm.
Najprv sme hodnotili biologické aktivity urbenamidu a jeho medziproduktov z hľadiska ich schopnosti modulovať rast rastlín.Do MS agarového média sme pridali rôzne koncentrácie ursmonamidu 1 alebo kyseliny ursmonovej 6 a na tomto médiu sme kultivovali sadenice Arabidopsis thaliana.Tieto testy ukázali, že vysoké koncentrácie (500 uM) zlúčeniny 6 inhibovali rast koreňov (obr. 2b).Ďalej sme vytvorili rôzne deriváty nahradením polohy N1 6 a vykonali sme na nich štúdie vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou (proces analógovej syntézy je opísaný v podporných informáciách (SI)).Sadenice Arabidopsis sa pestovali na médiu obsahujúcom 50 uM derivátov kyseliny ursonovej a merala sa dĺžka koreňa.ako je znázornené na obrázku.Ako je znázornené na obrázkoch 3a, b a S1, kumamokyseliny majú rôzne dĺžky lineárnych alkoxylových reťazcov (9, 10, 11, 12 a 13) alebo veľkých alkoxylových reťazcov (15, 16 a 17) v polohe N1.Deriváty vykazovali významnú inhibíciu rastu koreňov.Okrem toho sme zistili, že aplikácia 200 μM 10, 11 alebo 17 inhibovala klíčenie (obr. 3c a S2).
Štúdium vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou Kumamoto amidu a príbuzných zlúčenín.a) Štruktúra a schéma syntézy analógov.b ) Kvantifikácia dĺžky koreňov 7-dňových sadeníc pestovaných na médiu MS s alebo bez 50 μM derivátov kumamonamidu.Hviezdičky označujú významné rozdiely s falošnou liečbou (t test, s< 0,05).n>18. Údaje sú uvedené ako priemer ± SD.nt znamená „netestované“, pretože viac ako 50 % semien nevyklíčilo.(c) Kvantifikácia rýchlosti klíčenia ošetrených semien inkubovaných počas 7 dní v médiu MS s alebo bez 200 μM kumamonamidu a príbuzných zlúčenín.Hviezdičky označujú významné rozdiely pri simulovanej liečbe (chí-kvadrát test).n = 96.
Je zaujímavé, že pridanie alkylových bočných reťazcov dlhších ako C9 znížilo inhibičnú aktivitu, čo naznačuje, že zlúčeniny príbuzné kyseline kumamotovej vyžadujú bočné reťazce určitej veľkosti, aby vykazovali svoju biologickú aktivitu.
Pretože analýza vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou ukázala, že C9 bol modifikovaný na kyselinu ursonovú a nonyloxyderivát kyseliny ursonovej (ďalej označovaný ako KAND 11) bol najúčinnejším inhibítorom rastu rastlín, vykonali sme podrobnejšiu charakterizáciu KAND 11. Liečba Arabidopsis s 50 μM KAND 11 takmer úplne zabránili klíčeniu, zatiaľ čo nižšie koncentrácie (40, 30, 20 alebo 10 μM) KAND 11 inhibovali rast koreňov spôsobom závislým od dávky (obr. 4a, b).Aby sme otestovali, či KAND 11 ovplyvňuje životaschopnosť koreňových meristémov, skúmali sme koreňové meristémy zafarbené propidium jodidom (PI) a merali sme veľkosť oblasti meristémov.Veľkosť meristému semenáčikov pestovaných na médiu obsahujúcom 25 μM KAND-11 bola 151,1 ± 32,5 μm, pričom veľkosť meristému semenáčikov pestovaných na kontrolnom médiu obsahujúcom DMSO bola 264,7 ± 30,8 μm (obr. 4c, d). , čo naznačuje, že KAND-11 obnovuje bunkovú aktivitu.rozširovanie, šírenie.Koreňový meristém.V súlade s tým liečba KAND 11 znížila množstvo signálu bunkového delenia CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS v koreňovom meristéme (obr. 4e)17.Tieto výsledky naznačujú, že KAND 11 inhibuje rast koreňov znížením aktivity bunkovej proliferácie.
Analýza inhibičného účinku derivátov kyseliny urbenónovej (urbenyloxyderiváty) na rast.(a) 7-dňové sadenice Col divokého typu pestované na platniach MS s uvedenými koncentráciami KAND 11. Mierka = 1 cm.b) Kvantifikácia dĺžky koreňa.Písmená označujú významné rozdiely (Tukey HSD test, s< 0,05).n>16. Údaje sú uvedené ako priemer ± SD.(c) Konfokálna mikroskopia koreňov Col divokého typu zafarbených propidium jodidom pestovaných na platniach MS s alebo bez 25 μM KAND 11. Biele zátvorky označujú koreňový meristém.Mierka = 100 um.d) Kvantifikácia veľkosti koreňového meristému (n = 10 až 11).Štatistické rozdiely boli stanovené pomocou t-testu (str< 0,05).Stĺpce predstavujú priemernú veľkosť meristému.(e) Diferenčná interferenčná kontrastná (DIC) mikroskopia koreňového meristému obsahujúceho konštrukt CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS farbené a farbené na 5-dňových semenákoch pestovaných na MS platniach s alebo bez 25 uM KAND testu.
Fytotoxicita KAND 11 bola ďalej testovaná s použitím ďalšej dvojklíčnolistovej rastliny, tabaku (Nicotiana tabacum), a hlavného modelového organizmu suchozemskej rastliny, pečeňovníka (Marchantia polymorpha).Rovnako ako v prípade Arabidopsis, semenáčiky tabaku SR-1 pestované na médiu obsahujúcom 25 μM KAND 11 produkovali kratšie korene (obr. 5a).Okrem toho 40 zo 48 semien vyklíčilo na platniach obsahujúcich 200 μM KAND 11, zatiaľ čo všetkých 48 semien vyklíčilo na falošne ošetrenom médiu, čo naznačuje, že vyššie koncentrácie KAND boli významné (p< 0,05;chi test -štvorec) inhiboval klíčenie tabaku.(obr. 5b).Okrem toho koncentrácia KAND 11, ktorá inhibovala rast baktérií v pečeňovke, bola podobná účinnej koncentrácii v Arabidopsis (obr. 5c).Tieto výsledky naznačujú, že KAND 11 môže inhibovať rast rôznych rastlín.Potom sme skúmali možnú cytotoxicitu zlúčenín príbuzných medvedím monoamidom v iných organizmoch, konkrétne v ľudských HeLa bunkách a Escherichia coli kmeň DH5α, ako predstaviteľoch vyšších živočíšnych a bakteriálnych buniek.V sérii testov bunkovej proliferácie sme pozorovali, že kumamonamid 1, kyselina kumamonamidová 6 a KAND 11 neovplyvnili rast buniek HeLa alebo E. coli pri koncentráciách 100 uM (obr. 5d, e).
Inhibícia rastu KAND 11 v organizmoch iných ako Arabidopsis.(a) Dvojtýždňové sadenice tabaku SR-1 divokého typu sa pestovali na vertikálne umiestnených platniach MS obsahujúcich 25 μM KAND 11. (b) Dvojtýždňové sadenice tabaku SR-1 divokého typu sa pestovali na vodorovne umiestnených MS doštičky obsahujúce 200 μM KAND 11. (c) Dvojtýždňové púčiky pečeňovky Tak-1 divého typu pestované na platniach Gamborg B5 s uvedenými koncentráciami KAND 11. Červené šípky označujú spóry, ktoré prestali rásť počas dvojtýždňovej inkubácie obdobie.(d) Test bunkovej proliferácie buniek HeLa.Počet životaschopných buniek sa meral v pevných časových intervaloch pomocou súpravy na počítanie buniek 8 (Dojindo).Ako kontrola boli bunky HeLa ošetrené 5 μg/ml aktinomycínu D (Act D), ktorý inhibuje transkripciu RNA polymerázy a spôsobuje bunkovú smrť.Analýzy sa uskutočňovali trojmo.(e) Test proliferácie buniek E. coli.Rast E. coli sa analyzoval meraním OD600.Ako kontrola boli bunky ošetrené 50 ug/ml ampicilínu (Amp), ktorý inhibuje syntézu bakteriálnej bunkovej steny.Analýzy sa uskutočňovali trojmo.
Aby sme dešifrovali mechanizmus účinku cytotoxicity spôsobenej zlúčeninami príbuznými uramidu, znovu sme analyzovali deriváty kyseliny urbenovej so strednými inhibičnými účinkami.ako je znázornené na obrázku.Ako je znázornené na obrázkoch 2b, 6a, semenáčiky pestované na agarových platniach obsahujúcich vysoké koncentrácie (200 μM) kyseliny urmotónovej 6 produkovali kratšie a vľavo zakrivené korene (θ = – 23,7 ± 6,1), zatiaľ čo semenáčiky pestované na kontrolnom médiu sadenice produkovali takmer rovné korene (θ = – 3,8 ± 7,1).Je známe, že tento charakteristický šikmý rast je výsledkom dysfunkcie kortikálnych mikrotubulov14,18.V súlade s týmto zistením liečivá destabilizujúce mikrotubuly disopyramid a oryzalín vyvolali podobné nakláňanie koreňov v našich podmienkach rastu (obr. 2b, 6a).Zároveň sme testovali deriváty kyseliny urmotónovej a vybrali niekoľko z nich, ktoré v určitých koncentráciách vyvolávali rast šikmých koreňov.Zlúčeniny 8, 9 a 15 zmenili smer rastu koreňov pri 75 μM, 50 μM a 40 μM, v danom poradí, čo naznačuje, že tieto zlúčeniny môžu účinne destabilizovať mikrotubuly (obr. 2b, 6a).Testovali sme aj najsilnejší derivát kyseliny ursolovej, KAND 11, v nižšej koncentrácii (15 µM) a zistili sme, že aplikácia KAND 11 inhibovala rast koreňov a že smer rastu koreňov bol nerovnomerný, hoci mali tendenciu nakláňať sa doľava ( Obrázok C3)..Pretože vyššie koncentrácie liečiv destabilizujúcich mikrotubuly niekedy skôr inhibujú rast rastlín než spôsobujú naklonenie koreňov, následne sme vyhodnotili možnosť, že KAND 11 ovplyvňuje mikrotubuly pozorovaním kortikálnych mikrotubulov v koreňových epidermálnych bunkách.Imunohistochémia s použitím anti-β-tubulínových protilátok v epidermálnych bunkách koreňov sadeníc ošetrených 25 μM KAND 11 ukázala vymiznutie takmer všetkých kortikálnych mikrotubulov v epidermálnych bunkách v zóne predĺženia (obr. 6b).Tieto výsledky naznačujú, že kyselina kumamotónová a jej deriváty pôsobia priamo alebo nepriamo na mikrotubuly, aby ich rozrušili, a že tieto zlúčeniny sú novými inhibítormi mikrotubulov.
Kyselina ursonová a jej deriváty menia kortikálne mikrotubuly v Arabidopsis thaliana.a) Uhol sklonu koreňa meraný v prítomnosti rôznych derivátov kyseliny urmotónovej v uvedených koncentráciách.Analyzovali sa aj účinky dvoch zlúčenín, o ktorých je známe, že inhibujú mikrotubuly: disopyramidu a oryzalínu.Vložka zobrazuje štandard používaný na meranie uhla rastu koreňov.Hviezdičky označujú významné rozdiely s falošnou liečbou (t test, s< 0,05).n>19. Mierka = 1 cm.(b) Kortikálne mikrotubuly v epidermálnych bunkách v elongačnej zóne.Mikrotubuly v koreňoch Arabidopsis Col divokého typu pestované na platniach MS s 25 μM KAND 11 alebo bez nich boli vizualizované imunohistochemickým farbením s použitím primárnych protilátok β-tubulínu a sekundárnych protilátok konjugovaných s Alexa Fluor.Mierka = 10 um.(c) Mitotická štruktúra mikrotubulov v koreňovom meristéme.Mikrotubuly sa vizualizovali pomocou imunohistochemického farbenia.Mitotické štruktúry, vrátane profáznych zón, vretien a fragmoplastov, boli spočítané z konfokálnych obrazov.Šípky označujú štruktúry mitotických mikrotubulov.Hviezdičky označujú významné rozdiely s falošnou liečbou (t test, s< 0,05).n>9. Mierka = 50 um.
Hoci má Ursa schopnosť narušiť funkciu mikrotubulov, očakáva sa, že jej mechanizmus účinku bude odlišný od typických činidiel na depolymerizáciu mikrotubulov.Napríklad vyššie koncentrácie činidiel depolymerizujúcich mikrotubuly, ako je disopyramid a oryzalín, indukujú anizotropnú expanziu epidermálnych buniek, zatiaľ čo KAND 11 nie.Okrem toho spoločná aplikácia KAND 11 a disopyramidu viedla ku kombinovanej reakcii rastu koreňov vyvolanej disopyramidom a bola pozorovaná inhibícia rastu indukovaná KAND 11 (obr. S4).Analyzovali sme aj odpoveď hypersenzitívneho mutantu disopyramidu 1-1 (phs1-1) na KAND 11. phs1-1 má nekanonickú bodovú mutáciu tubulínkinázy a pri ošetrení dizopyramidom produkuje kratšie korene9,20.Sadenice mutantu phs1-1 pestované na agarovom médiu obsahujúcom KAND 11 mali kratšie korene podobné tým, ktoré rástli na disopyramíde (obr. S5).
Okrem toho sme pozorovali mitotické mikrotubulové štruktúry, ako sú profázne zóny, vretienka a fragmoplasty, v koreňovom meristéme sadeníc ošetrených KAND 11. V súlade s pozorovaniami pre CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, významný pokles bol pozorovaný počet mitotických mikrotubulov (obr. .6c).
Aby sme charakterizovali cytotoxicitu KAND 11 pri subcelulárnom rozlíšení, ošetrili sme bunky suspenzie tabaku BY-2 pomocou KAND 11 a pozorovali sme ich reakciu.Najprv sme pridali KAND 11 do buniek BY-2 exprimujúcich TagRFP-TUA6, ktorý fluorescenčne označuje mikrotubuly, aby sme vyhodnotili účinok KAND 11 na kortikálne mikrotubuly.Hustota kortikálnych mikrotubulov bola hodnotená pomocou analýzy obrazu, ktorá kvantifikovala percento cytoskeletálnych pixelov medzi cytoplazmatickými pixelmi.Výsledky testu ukázali, že po ošetrení 50 μM alebo 100 μM KAND 11 počas 1 hodiny sa hustota výrazne znížila na 0,94 ± 0,74 % alebo 0,23 ± 0,28 %, zatiaľ čo hustota buniek ošetrených DMSO bola 1,61 ± 0,34. % (obr. 7a).Tieto výsledky sú v súlade s pozorovaním u Arabidopsis, že liečba KAND 11 indukuje depolymerizáciu kortikálnych mikrotubulov (obr. 6b).Tiež sme skúmali líniu BY-2 s aktínovými vláknami značenými GFP-ABD po ošetrení rovnakou koncentráciou KAND 11 a pozorovali sme, že ošetrenie KAND 11 narušilo aktínové vlákna.Ošetrenie 50 μM alebo 100 μM KAND 11 počas 1 hodiny významne znížilo hustotu aktínových filamentov na 1,20 ± 0,62 % alebo 0,61 ± 0,26 %, v danom poradí, zatiaľ čo hustota v bunkách ošetrených DMSO bola 1,69 ± 0,51 % (obr. 2).7b).Tieto výsledky kontrastujú s účinkami propyzamidu, ktorý neovplyvňuje aktínové vlákna, a latrunkulínu B, depolymerizéra aktínu, ktorý neovplyvňuje mikrotubuly (SI obrázok S6).Okrem toho ošetrenie kumamonamidom 1, kumamonamidovou kyselinou 6 alebo KAND 11 neovplyvnilo mikrotubuly v bunkách HeLa (SI obrázok S7).Predpokladá sa teda, že mechanizmus účinku KAND 11 je odlišný od mechanizmu známych disruptorov cytoskeletu.Okrem toho naše mikroskopické pozorovanie buniek BY-2 ošetrených KAND 11 odhalilo začiatok bunkovej smrti počas liečby KAND 11 a ukázalo, že podiel mŕtvych buniek zafarbených Evansovou modrou sa po 30 minútach liečby KAND 11 významne nezvýšil, zatiaľ čo po 90 minútach pôsobenia 50 μM alebo 100 μM KAND sa počet mŕtvych buniek zvýšil na 43,7 % alebo 80,1 % (obr. 7c).Celkovo tieto údaje naznačujú, že nový derivát kyseliny ursolovej KAND 11 je rastlinne špecifický cytoskeletálny inhibítor s doteraz neznámym mechanizmom účinku.
KAND ovplyvňuje kortikálne mikrotubuly, aktínové vlákna a životaschopnosť tabakových BY-2 buniek.( a ) Vizualizácia kortikálnych mikrotubulov v bunkách BY-2 v prítomnosti TagRFP-TUA6.Bunky BY-2 ošetrené KAND 11 (50 uM alebo 100 uM) alebo DMSO sa skúmali konfokálnou mikroskopiou.Hustota kortikálnych mikrotubulov sa vypočítala z mikrofotografie 25 nezávislých buniek.Písmená označujú významné rozdiely (Tukey HSD test, s< 0,05).Mierka = 10 um.( b ) Kortikálne aktínové vlákna v bunkách BY-2 vizualizované v prítomnosti GFP-ABD2.Bunky BY-2 ošetrené KAND 11 (50 uM alebo 100 uM) alebo DMSO sa skúmali konfokálnou mikroskopiou.Hustota kortikálnych aktínových filamentov sa vypočítala z mikrografií 25 nezávislých buniek.Písmená označujú významné rozdiely (Tukey HSD test, s< 0,05).Mierka = 10 um.(c) Pozorovanie mŕtvych buniek BY-2 farbením Evansovou modrou.Bunky BY-2 ošetrené KAND 11 (50 uM alebo 100 uM) alebo DMSO sa skúmali mikroskopiou v jasnom poli.n=3.Mierka = 100 um.
Objav a aplikácia nových prírodných produktov viedla k významnému pokroku v rôznych aspektoch ľudského života, vrátane medicíny a poľnohospodárstva.Na získanie užitočných zlúčenín z prírodných zdrojov sa uskutočnil historický výskum.Najmä je známe, že aktinomycéty sú užitočné ako antiparazitické antibiotiká pre háďatká vďaka svojej schopnosti produkovať rôzne sekundárne metabolity, ako je avermektín, hlavná zlúčenina ivermektínu a bleomycín a jeho deriváty, používané v medicíne ako protirakovinové činidlo21,22.Podobne boli z aktinomycét objavené rôzne herbicídne zlúčeniny, z ktorých niektoré sú už komerčne používané1,23.Preto sa analýza metabolitov aktinomycét na izoláciu prírodných produktov s požadovanými biologickými aktivitami považuje za účinnú stratégiu.V tejto štúdii sme objavili novú zlúčeninu, kumamonamid, zo S. werraensis a úspešne ju syntetizovali.Kyselina ursonová je syntetický medziprodukt urbenamidu a jeho derivátov.Môže spôsobiť charakteristické zvlnenie koreňov, vykazovať strednú až silnú herbicídnu aktivitu a priamo alebo nepriamo poškodzovať mikrotubuly rastlín.Mechanizmus účinku kyseliny urmotónovej sa však môže líšiť od mechanizmu účinku existujúcich inhibítorov mikrotubulov, pretože KAND 11 tiež narúša aktínové vlákna a spôsobuje bunkovú smrť, čo naznačuje regulačný mechanizmus, ktorým kyselina urmotónová a jej deriváty ovplyvňujú širokú škálu cytoskeletálnych štruktúr..
Ďalšia podrobná charakterizácia kyseliny urbenónovej pomôže lepšie pochopiť mechanizmus účinku kyseliny urbenónovej.Ďalším cieľom je najmä vyhodnotiť schopnosť kyseliny ursonovej viazať sa na redukované mikrotubuly, aby sa určilo, či kyselina ursonová a jej deriváty pôsobia priamo na mikrotubuly a depolymerizujú ich, alebo či ich pôsobenie vedie k destabilizácii mikrotubulov.Okrem toho v prípade, že mikrotubuly nie sú priamym cieľom, identifikácia miesta pôsobenia a molekulárnych cieľov kyseliny ursonovej na rastlinných bunkách pomôže ďalej pochopiť vlastnosti príbuzných zlúčenín a možné spôsoby zlepšenia herbicídnej aktivity.Náš test biologickej aktivity odhalil jedinečnú cytotoxickú schopnosť kyseliny ursonovej na rast rastlín, ako je Arabidopsis thaliana, tabak a pečeňovka, zatiaľ čo bunky E. coli ani HeLa neboli ovplyvnené.Malá alebo žiadna toxicita pre živočíšne bunky je výhodou derivátov kyseliny ursonovej, ak sú vyvinuté ako herbicídy na použitie na otvorených poľnohospodárskych poliach.Pretože mikrotubuly sú bežné štruktúry v eukaryotoch, ich selektívna inhibícia v rastlinách je kľúčovou požiadavkou na herbicídy.Napríklad propyzamid, činidlo depolymerizujúce mikrotubuly, ktoré sa priamo viaže na tubulín a inhibuje polymerizáciu, sa používa ako herbicíd kvôli svojej nízkej toxicite pre živočíšne bunky24.Na rozdiel od dizopyramidu majú príbuzné benzamidy rôzne cieľové špecificity.Okrem rastlinných mikrotubulov inhibuje RH-4032 alebo benzoxamid aj mikrotubuly živočíšnych buniek, respektíve oomycét, a zalilamid sa používa ako fungicíd pre svoju nízku fytotoxicitu25,26,27.Novoobjavený medveď a jeho deriváty vykazujú selektívnu cytotoxicitu voči rastlinám, ale stojí za zmienku, že ďalšie modifikácie môžu zmeniť ich cieľovú špecifickosť a potenciálne poskytnúť ďalšie deriváty na kontrolu patogénnych húb alebo oomycét.
Jedinečné vlastnosti kyseliny urbenónovej a jej derivátov sú užitočné pre ich vývoj ako herbicídov a použitie ako výskumných nástrojov.Význam cytoskeletu pri kontrole tvaru rastlinných buniek je široko uznávaný.Skoršie štúdie ukázali, že rastliny vyvinuli komplexné mechanizmy organizácie kortikálnych mikrotubulov riadením dynamiky mikrotubulov, aby správne kontrolovali morfogenézu.Bol identifikovaný veľký počet molekúl zodpovedných za reguláciu aktivity mikrotubulov a súvisiaci výskum stále prebieha3,4,28.Naše súčasné chápanie dynamiky mikrotubulov v rastlinných bunkách úplne nevysvetľuje mechanizmy organizácie kortikálnych mikrotubulov.Napríklad, aj keď disopyramid aj oryzalín môžu depolymerizovať mikrotubuly, dizopyramid spôsobuje vážne narušenie koreňov, zatiaľ čo oryzalín má relatívne mierny účinok.Navyše mutácie v tubulíne, ktorý stabilizuje mikrotubuly, tiež spôsobujú pravotočivosť koreňov, zatiaľ čo paklitaxel, ktorý tiež stabilizuje dynamiku mikrotubulov, nie.Štúdium a identifikácia molekulárnych cieľov kyseliny ursolovej by preto mala poskytnúť nový pohľad na reguláciu rastlinných kortikálnych mikrotubulov.Podobne budúce porovnania chemikálií, ktoré sú účinné pri podpore narušeného rastu, ako je disopyramid, a menej účinných chemikálií, ako je oryzalín alebo kyselina kumamotorová, poskytnú vodítka k tomu, ako dochádza k deformovanému rastu.
Na druhej strane cytoskeletálne preskupenia súvisiace s obranou sú ďalšou možnosťou na vysvetlenie cytotoxicity kyseliny ursonovej.Infekcia patogénu alebo zavedenie elicitora do rastlinných buniek niekedy spôsobí deštrukciu cytoskeletu a následnú bunkovú smrť29.Napríklad bolo hlásené, že kryptoxantín odvodený od oomycét narušuje mikrotubuly a aktínové vlákna pred smrťou tabakových buniek, podobne ako pri liečbe KAND30,31.Podobnosti medzi obrannými odpoveďami a bunkovými odpoveďami vyvolanými kyselinou ursonovou nás viedli k hypotéze, že spúšťajú bežné bunkové procesy, hoci je evidentný rýchlejší a silnejší účinok kyseliny ursonovej ako kryptoxantínu.Štúdie však ukázali, že narušenie aktínových filamentov podporuje spontánnu bunkovú smrť, ktorá nie je vždy sprevádzaná porušením mikrotubulov29.Okrem toho je potrebné zistiť, či buď patogén alebo elicitor spôsobuje deformovaný rast koreňov, ako to robia deriváty kyseliny ursonovej.Molekulárne poznatky spájajúce obranné reakcie a cytoskelet sú teda atraktívnym problémom, ktorý treba riešiť.Využitím prítomnosti zlúčenín s nízkou molekulovou hmotnosťou príbuzných kyseline ursonovej, ako aj radu derivátov s rôznou účinnosťou, môžu poskytnúť príležitosti na zacielenie na neznáme bunkové mechanizmy.
Súhrnne povedané, objav a aplikácia nových zlúčenín, ktoré modulujú dynamiku mikrotubulov, poskytnú výkonné metódy na riešenie zložitých molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom určovania tvaru rastlinných buniek.V tejto súvislosti môže nedávno vyvinutá zlúčenina kyselina urmotónová, ktorá ovplyvňuje mikrotubuly a aktínové vlákna a indukuje bunkovú smrť, poskytnúť príležitosť na dešifrovanie spojenia medzi kontrolou mikrotubulov a týmito ďalšími mechanizmami.Chemická a biologická analýza s použitím kyseliny urbenónovej nám teda pomôže pochopiť molekulárne regulačné mechanizmy, ktoré riadia cytoskelet rastliny.
Naočkujte S. werraensis MK493-CF1 do 500 ml Erlenmeyerovej banky s prepážkami obsahujúcej 110 ml zárodočného média pozostávajúceho z 2 % (w/v) galaktózy, 2 % (w/v) pasty Essence, 1 % ( w/v) Bacto kompozície .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (w/v) kukuričný extrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonsko), 0,2 % (w/v) (NH4)2S04 a 0,2 % CaC03 v deionizovanej vode.(pH 7,4 pred sterilizáciou).Očkovacie kultúry sa inkubovali na rotačnej trepačke (180 ot./min.) pri 27 °C počas 2 dní.Produkčná kultivácia prostredníctvom fermentácie v tuhom stave.Očkovacia kultúra (7 ml) bola prenesená do 500 ml K-1 banky obsahujúcej 40 g produkčného média pozostávajúceho z 15 g lisovaného jačmeňa (MUSO Co., Ltd., Japonsko) a 25 g deionizovanej vody (pH neupravené pred sterilizáciou).).Fermentácia prebiehala pri 30 °C v tme počas 14 dní.Fermentačný materiál bol extrahovaný 40 ml/fľaša EtOH a centrifugovaný (1500 g, 4 °C, 10 minút).Kultivačný supernatant (60 ml) sa extrahoval zmesou 10 % MeOH/EtOAc.Organická vrstva sa odparila za zníženého tlaku, čím sa získal zvyšok (59,5 mg), ktorý sa podrobil HPLC s gradientovou elúciou (0–10 minút: 90 %) na kolóne s reverznou fázou (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × dĺžka 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minút: 90 % H2O/CH3CN až 70 % H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minút: 90 % H2O/EtOH, 45–155 minút: 90 % H2O /EtOH na 100 % EtOH (gradient (gradient), 155 – 200 min: 100 % EtOH) pri prietokovej rýchlosti 1,5 ml/min sa izoloval kumamonamid (1, 36,0 mg) ako biely amorfný prášok.
kumamotoamid(1);1H-NMR (500 MHz, CDCI3) 5 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1 H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1 H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1 H).4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDC13) 5 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N202]+ vypočítaná hodnota: 141,0659, nameraná hodnota: 141,0663, IR vmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm-1537 cm
Semená Columbia (Col-0) boli získané z Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) s povolením na výskumné použitie.Semená Col-0 boli množené a udržiavané v našich laboratórnych podmienkach a použité ako rastliny Arabidopsis divokého typu.Semená Arabidopsis boli povrchovo sterilizované a kultivované v médiu Murashige a Skoog s polovičnou silou obsahujúcom 2 % sacharózy (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (w/v) kyseliny 2-(4-morfolino)etánsulfónovej (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) a 1,5 % agaru (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, pri 23 °C a konštantnom svetle.Semená mutantu phs1-1 poskytol T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Semená kmeňa SR-1 poskytol T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) a použili sa ako rastliny tabaku divokého typu.Semená tabaku boli povrchovo sterilizované a namočené v sterilnej vode na tri noci, aby sa podporilo klíčenie, a potom boli umiestnené do roztoku s polovičnou silou obsahujúceho 2 % sacharózy, 0,05 % (w/v) MES a 0,8 % gumy gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.a Skoogovo médium) s pH 5,7 a inkubované pri 23 °C za stáleho svetla.
Kmeň Tak-1 poskytol T. Kohchi (Kyoto University) a bol použitý ako štandardná experimentálna jednotka pre štúdiu pečeňovky.Gemma sa získala zo sterilizovaných kultivovaných rastlín a potom sa naniesla na médium Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) s obsahom 1 % sacharózy a 0,3 % gumy gellan a inkubovala sa pri 23 °C pod nepretržitým svetlom.
Tabakové bunky BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) poskytla S. Hasezawa (University of Tokyo).Bunky BY-2 sa zriedili 95-krát v modifikovanom Linsmeierovom a Skoogovom médiu a týždenne sa doplnili kyselinou 2,4-dichlórfenoxyoctovou32.Bunková suspenzia sa miešala na rotačnej trepačke pri 130 ot./min. pri 27 °C v tme.Premyte bunky 10-násobným objemom čerstvého média a resuspendujte v rovnakom médiu.Transgénne bunkové línie BY-2 stabilne exprimujúce mikrotubulový marker TagRFP-TUA6 alebo aktínový filamentový marker GFP-ABD2 pod promótorom 35S vírusu karfiolovej mozaiky boli vytvorené tak, ako je opísané33,34,35.Tieto bunkové línie sa môžu udržiavať a synchronizovať s použitím postupov podobných tým, ktoré sa používajú pre pôvodnú bunkovú líniu BY-2.
HeLa bunky sa kultivovali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) (Life Technologies) doplnenom 10 % fetálnym hovädzím sérom, 1,2 U/ml penicilínu a 1,2 ug/ml streptomycínu v inkubátore pri 37 °C s 5 % CO2.
Všetky experimenty opísané v tomto rukopise boli vykonané v súlade s japonskými nariadeniami a usmerneniami o biologickej bezpečnosti.
Zlúčeniny sa rozpustili v dimetylsulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ako zásobné roztoky a zriedili sa v médiu MS pre Arabidopsis a tabak alebo v médiu Gamborg B5 pre pečeňovník.Na test inhibície rastu koreňov sa na agarové médium obsahujúce uvedené zlúčeniny alebo DMSO vysialo viac ako 10 semien na misku.Semená boli inkubované v rastovej komore počas 7 dní.Sadenice boli odfotografované a bola zmeraná dĺžka koreňov.Na test klíčenia Arabidopsis sa 48 semien na misku vysialo na agarové médium obsahujúce 200 uM zlúčeniny alebo DMSO.Semená Arabidopsis sa pestovali v rastovej komore a počet vyklíčených sadeníc sa spočítal 7 dní po vyklíčení (dag).Na test klíčenia tabaku sa 24 semien na misku vysialo na agarové médium obsahujúce 200 uM KAND alebo DMSO.Semená tabaku sa pestovali v rastovej komore a po 14 dňoch sa spočítal počet vyklíčených sadeníc.Na test inhibície rastu pečeňovky sa 9 embryí z každej platne umiestnilo na agarové médium obsahujúce uvedené koncentrácie KAND alebo DMSO a inkubovalo sa v rastovej komore počas 14 dní.
Na vizualizáciu organizácie koreňového meristému použite sadenice zafarbené 5 mg/ml propidium jodidu (PI).PI signály sa pozorovali fluorescenčnou mikroskopiou s použitím konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopu TCS SPE (Leica Microsystems).
Histochemické farbenie koreňov β-glukuronidázou (GUS) sa uskutočnilo podľa protokolu opísaného Malami a Benfey36.Sadenice sa fixovali v 90 % acetóne cez noc, zafarbili sa 0,5 mg/ml kyseliny 5-bróm-4-chlór-3-indolyl-p-d-glukurónovej v pufri GUS na 1 hodinu a umiestnili sa do hydratovaného roztoku chlóraldehydu.(8 g chloralhydrátu, 2 ml vody a 1 ml glycerolu) a pozorované diferenciálnou interferenčnou kontrastnou mikroskopiou s použitím mikroskopu Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Uhly koreňov sa merali na 7-dňových sadeniciach pestovaných na vertikálne umiestnených platniach.Zmerajte uhol koreňa od smeru gravitačného vektora, ako je opísané v kroku 6.
Usporiadanie kortikálnych mikrotubulov bolo pozorované tak, ako je opísané, s malými modifikáciami protokolu37.Anti-β-tubulínová protilátka (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) a Alexa Fluor 488-konjugovaný anti-myší IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) boli použité ako primárne a sekundárne protilátky v riedeniach 1:1000 a 1:100, resp.Fluorescenčné snímky sa získali pomocou konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopu TCS SPE (Leica Microsystems).Získajte obrázky Z-stack a vytvorte projekcie s maximálnou intenzitou podľa pokynov výrobcu.
Test proliferácie buniek HeLa sa uskutočnil pomocou súpravy Cell Counting Kit 8 (Dojindo) podľa pokynov výrobcu.
Rast E. coli DH5a sa analyzoval meraním hustoty buniek v kultúre pomocou spektrofotometra pri 600 nm (OD600).
Cytoskeletálna organizácia v transgénnych BY-2 bunkách bola pozorovaná pomocou fluorescenčného mikroskopu vybaveného konfokálnym skenovacím zariadením CSU-X1 (Yokogawa) a sCMOS kamerou (Zyla, Andor Technology).Cytoskeletálna hustota bola hodnotená obrazovou analýzou, ktorá kvantifikovala percento cytoskeletálnych pixelov medzi cytoplazmatickými pixelmi v konfokálnych obrázkoch pomocou softvéru ImageJ, ako je opísané38, 39.
Na detekciu bunkovej smrti v bunkách BY-2 sa alikvotná časť bunkovej suspenzie inkubovala s 0,05 % Evansovou modrou počas 10 minút pri teplote miestnosti.Selektívne farbenie odumretých buniek Evansovou modrou závisí od extrúzie farbiva zo životaschopných buniek intaktnou plazmatickou membránou40.Zafarbené bunky sa pozorovali pomocou mikroskopu s jasným poľom (BX53, Olympus).
Bunky HeLa sa pestovali v DMEM doplnenom 10 % FBS vo zvlhčenom inkubátore pri 37 °C a 5 % C02.Bunky boli ošetrené 100 uM KAND 11, kyselinou kumamonámovou 6, kumamonamidom 1, 100 ng/ml colcemidom (Gibco) alebo 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) počas 6 hodín pri 37 °C.Bunky boli fixované MetOH počas 10 minút a potom acetátom počas 5 minút pri teplote miestnosti.Fixované bunky sa inkubovali s primárnou protilátkou p-tubulín (1D4A4, Proteintech: 66240-1) zriedenou v 0,5 % BSA/PBS počas 2 hodín, premyli sa 3-krát s TBST a potom sa inkubovali s kozou protilátkou Alexa Fluor.488 1 hodina.– Myší IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) a 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) zriedené v 0,5 % BSA/PBS.Po trojnásobnom premytí TBST sa zafarbené bunky pozorovali na inverznom mikroskope Nikon Eclipse Ti-E.Obrázky boli zachytené chladenou CCD kamerou Hamamatsu ORCA-R2 pomocou softvéru MetaMorph (Molecular Devices).
Čas odoslania: 17. júna 2024