Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie najlepších výsledkov odporúčame používať novšiu verziu prehliadača (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Objav a prospešné využitie prírodných produktov môže pomôcť zlepšiť ľudský život. Chemikálie inhibujúce rast rastlín sa široko používajú ako herbicídy na kontrolu buriny. Vzhľadom na potrebu používať rôzne typy herbicídov je potrebné identifikovať zlúčeniny s novými mechanizmami účinku. V tejto štúdii sme objavili novú N-alkoxypyrolovú zlúčeninu, kumamonamid, zo Streptomyces werraensis MK493-CF1 a stanovili sme kompletný proces syntézy. Prostredníctvom testov biologickej aktivity sme zistili, že kyselina urs-monoamová je syntetický medziprodukt urs-monoamidu a potenciálny...inhibítor rastu rastlínOkrem toho sme vyvinuli rôzne deriváty kyseliny urbenonovej, vrátane derivátu urbenonovej (UDA), ktorý má vysokú herbicídnu aktivitu bez negatívneho vplyvu na rast buniek HeLa. Zistili sme tiež, že deriváty kyseliny urmotonovej narúšajú rastlinné mikrotubuly; okrem toho KAND ovplyvňuje aktínové filamenty a indukuje bunkovú smrť; Tieto mnohostranné účinky sa líšia od účinkov známych inhibítorov mikrotubulov a naznačujú nový mechanizmus účinku kyseliny ursónovej, čo predstavuje dôležitú výhodu pri vývoji nových herbicídov.
Objav a praktické využitie prospešných prírodných produktov a ich derivátov je prostriedkom na zlepšenie kvality ľudského života. Sekundárne metabolity produkované mikroorganizmami, rastlinami a hmyzom viedli k významnému pokroku v medicíne a poľnohospodárstve. Z prírodných produktov bolo vyvinutých mnoho antibiotík a liekov proti leukémii. Okrem toho rôzne druhypesticídyZ týchto prírodných produktov sa extrahujú fungicídy a herbicídy na použitie v poľnohospodárstve. Najmä herbicídy na kontrolu buriny sú dôležitými nástrojmi na zvyšovanie výnosov plodín v modernom poľnohospodárstve a rôzne typy zlúčenín sa už komerčne používajú. Niekoľko bunkových procesov v rastlinách, ako je fotosyntéza, metabolizmus aminokyselín, syntéza bunkovej steny, regulácia mitózy, signalizácia fytohormónov alebo syntéza bielkovín, sa považuje za typické ciele herbicídov. Zlúčeniny, ktoré inhibujú funkciu mikrotubulov, sú bežnou triedou herbicídov, ktoré ovplyvňujú rast rastlín ovplyvnením mitotickej regulácie2.
Mikrotubuly sú súčasťou cytoskeletu a sú široko konzervované v eukaryotických bunkách. Heterodimér tubulínu pozostáva z α-tubulínu a β-tubulínu, ktoré tvoria lineárne mikrotubulové protofilamenty, pričom 13 protofilamentov tvorí valcovitú štruktúru. Mikrotubuly hrajú v rastlinných bunkách viacero úloh vrátane určovania tvaru bunky, bunkového delenia a intracelulárneho transportu3,4. Rastlinné bunky obsahujú mikrotubuly pod interfázovou plazmatickou membránou a predpokladá sa, že tieto takzvané kortikálne mikrotubuly riadia organizáciu celulózových mikrofibríl prostredníctvom regulácie komplexov celulózovej syntázy4,5. Kortikálne mikrotubuly koreňových epidermálnych buniek, prítomné v zóne rýchleho predlžovania koreňového hrotu, sú umiestnené laterálne a celulózové mikrovlákna sledujú tieto mikrotubuly a obmedzujú smer expanzie buniek, čím podporujú anizotropné predlžovanie buniek. Funkcia mikrotubulov je preto úzko spojená s morfológiou rastliny. Substitúcie aminokyselín v génoch kódujúcich tubulín spôsobujú skreslenie kortikálnych mikrotubulových polí a rast vľavo alebo vpravo u Arabidopsis6,7. Podobne, mutácie v proteínoch asociovaných s mikrotubulami, ktoré regulujú dynamiku mikrotubulov, môžu tiež viesť k skreslenému rastu koreňov8,9,10,11,12,13. Okrem toho, ošetrenie herbicídmi narúšajúcimi mikrotubuly, ako je disopyramid, tiež známy ako pretilachlór, tiež spôsobuje ľavostranný šikmý rast koreňov14. Tieto údaje naznačujú, že presná regulácia funkcie mikrotubulov je rozhodujúca pre určenie smeru rastu rastlín.
Boli objavené rôzne typy inhibítorov mikrotubulov a tieto liečivá významne prispeli k výskumu cytoskeletu, ako aj k poľnohospodárstvu a medicíne2. Najmä oryzalín, dinitroanilínové zlúčeniny, disopyramid, zlúčeniny príbuzné benzamidu a ich analógy môžu inhibovať funkciu mikrotubulov a tým inhibovať rast rastlín. Preto sa široko používajú ako herbicídy. Keďže sú však mikrotubuly dôležitou súčasťou rastlinných a živočíšnych buniek, väčšina inhibítorov mikrotubulov je cytotoxická pre oba typy buniek. Preto sa napriek ich uznávanej použiteľnosti ako herbicídov na praktické účely používa obmedzený počet antimikrotubulárnych látok.
Streptomyces je rod z čeľade Streptomyces, ktorá zahŕňa aeróbne, grampozitívne, vláknité baktérie a je všeobecne známa svojou schopnosťou produkovať širokú škálu sekundárnych metabolitov. Preto sa považuje za jeden z najdôležitejších zdrojov nových biologicky aktívnych prírodných produktov. V súčasnej štúdii sme objavili novú zlúčeninu nazývanú kumamonamid, ktorá bola izolovaná zo Streptomyces werraensis MK493-CF1 a S. werraensis ISP 5486. Pomocou spektrálnej analýzy a plnej spektrálnej analýzy bola charakterizovaná štruktúra kumamonamidu a určený jeho jedinečný N-alkoxypyrolý skelet. Zistilo sa, že kyselina ursmonová, syntetický medziprodukt ursmonoamidu a jeho derivátov, inhibuje rast a klíčenie populárnej modelovej rastliny Arabidopsis thaliana. V štúdii vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou sme zistili, že zlúčenina s C9 modifikovanou na kyselinu ursónovú, nazývaná nonyloxyderivát kyseliny ursónovej (KAND), významne zvyšuje inhibičný účinok na rast a klíčenie. Je pozoruhodné, že novo objavený inhibítor rastu rastlín ovplyvnil aj rast tabaku a pečeňovky a nebol cytotoxický pre baktérie ani bunky HeLa. Okrem toho niektoré deriváty kyseliny urmotónovej indukujú skreslený fenotyp koreňov, čo naznačuje, že tieto deriváty priamo alebo nepriamo ovplyvňujú mikrotubuly. V súlade s touto myšlienkou naše pozorovania mikrotubulov značených buď imunohistochemicky, alebo fluorescenčnými proteínmi naznačujú, že liečba KAND depolymerizuje mikrotubuly. Okrem toho liečba derivátmi kyseliny kumamotónovej narušila aktínové mikrofilamenty. Objavili sme teda nový inhibítor rastu rastlín, ktorého jedinečný mechanizmus účinku zahŕňa deštrukciu cytoskeletu.
Kmeň MK493-CF1 bol izolovaný z pôdy v Shinagawa-ku v Tokiu. Kmeň MK493-CF1 tvoril dobre rozvetvené stromálne mycélium. Bola stanovená čiastočná sekvencia génu 16S ribozomálnej RNA (1422 bp). Tento kmeň je veľmi podobný S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typický kmeň, 99,93 %). Na základe tohto výsledku sa zistilo, že tento kmeň je blízko príbuzný s typovým kmeňom S. werraensis. Preto sme tento kmeň predbežne pomenovali S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T tiež produkuje rovnaké bioaktívne zlúčeniny. Keďže v ranom štádiu výskumu získavania prírodných produktov z tohto mikroorganizmu bolo málo, vykonal sa ďalší chemický výskum. Po kultivácii S. werraensis MK493-CF1 na jačmennom médiu fermentáciou v tuhom skupenstve pri teplote 30 °C počas 14 dní bolo médium extrahované 50 % EtOH. 60 ml vzorky bolo vysušených, čím sa získalo 59,5 mg surového extraktu. Surový extrakt bol podrobený HPLC s reverznou fázou, čím sa získal N-metoxy-1H-pyrol-2-karboxamid (1, nazývaný kumamonamid, 36,0 mg). Celkové množstvo zlúčeniny 1 predstavuje približne 60 % surového extraktu. Preto sme sa rozhodli podrobne študovať vlastnosti kumamoamidu 1.
Kumamonamid 1 je biely amorfný prášok a hmotnostná spektrometria s vysokým rozlíšením (HRESIMS) potvrdzuje C6H8N2O2 (Obr. 1). C2-substituovaný pyrolový fragment tejto zlúčeniny je charakterizovaný δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH v 1H NMR spektre: 4,5 Hz, H-5) a δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6) a 13C NMR spektrum ukazuje prítomnosť štyroch sp2 atómov uhlíka. Prítomnosť amidovej skupiny v polohe C2 bola stanovená pomocou HMBC korelácie od protónu C-3 k amidovému karbonylovému uhlíku pri δC 161,1. Okrem toho, píky 1H a 13C NMR pri δH 4,10 (3H, S) a δC 68,3 naznačujú prítomnosť N-metoxy skupín v molekule. Hoci správna poloha metoxy skupiny ešte nebola určená pomocou spektroskopickej analýzy, ako je napríklad zvýšená diferenčná spektroskopia a nukleárna Overhauserova skratka (NOEDF), N-metoxy-1H-pyrol-2-karboxamid sa stal prvou kandidátskou zlúčeninou.
Na určenie správnej štruktúry zlúčeniny 1 sa vykonala totálna syntéza (obr. 2a). Spracovaním komerčne dostupného 2-aminopyridínu 2 s m-CPBA vznikol zodpovedajúci N-oxid 3 v kvantitatívnom výťažku. Po 2-aminoazidácii zlúčeniny 2 sa uskutočnila cyklokondenzačná reakcia opísaná Abramovičom v benzéne pri 90 °C, čím sa získal požadovaný 1-hydroxy-1H-pyrol-2-karbonitril 5 v gramoch. Rýchlosť 60 % (dva stupne). 15,16. Metylácia a hydrolýza zlúčeniny 4 potom poskytli kyselinu 1-metoxy-1H-pyrol-2-karboxylovú (nazývanú „kyselina kumotónová“, 6) v dobrom výťažku (70 %, dva kroky). Nakoniec, amidácia cez medziprodukt chloridu kyseliny 6 s použitím vodného amoniaku poskytla Kumamotov amid 1 v 98 % výťažku. Všetky spektrálne údaje syntetizovanej zlúčeniny 1 boli podobné izolovanej zlúčenine 1, takže bola určená štruktúra zlúčeniny 1;
Všeobecná syntéza a analýza biologickej aktivity urbénamidu a kyseliny urbénovej. (a) Celková syntéza Kumamotovho amidu. (b) Sedemdňové sadenice divokého typu Arabidopsis Columbia (Col) boli pestované na miskách Murashige a Skoog (MS) obsahujúcich kumamonamid 6 alebo kumamonamid 1 v uvedených koncentráciách. Mierka = 1 cm.
Najprv sme zhodnotili biologické aktivity urbenámidu a jeho medziproduktov z hľadiska ich schopnosti modulovať rast rastlín. Do MS agarového média sme pridali rôzne koncentrácie ursmonamidu 1 alebo kyseliny ursmonovej 6 a na tomto médiu sme kultivovali sadenice Arabidopsis thaliana. Tieto testy ukázali, že vysoké koncentrácie (500 μM) zlúčeniny 6 inhibovali rast koreňov (obr. 2b). Následne sme vytvorili rôzne deriváty substitúciou pozície N1 zlúčeniny 6 a vykonali sme na nich štúdie vzťahu štruktúry a aktivity (proces syntézy analógov je opísaný v doplňujúcich informáciách (SI)). Sadenice Arabidopsis boli pestované na médiu obsahujúcom 50 μM derivátov kyseliny ursónovej a bola meraná dĺžka koreňov, ako je znázornené na obrázku. Ako je znázornené na obrázkoch 3a, b a S1, kyseliny kumamo majú rôzne dĺžky lineárnych alkoxy reťazcov (9, 10, 11, 12 a 13) alebo dlhých alkoxy reťazcov (15, 16 a 17) v pozícii N1. Deriváty vykazovali významnú inhibíciu rastu koreňov. Okrem toho sme zistili, že aplikácia 200 μM 10, 11 alebo 17 inhibovala klíčenie (obr. 3c a S2).
Štúdia vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou Kumamotovho amidu a príbuzných zlúčenín. (a) Štruktúra a schéma syntézy analógov. (b) Kvantifikácia dĺžky koreňov 7-dňových sadeníc pestovaných na MS médiu s alebo bez 50 μM derivátov kumamonamidu. Hviezdičky označujú významné rozdiely oproti simulovanej liečbe (t-test, p< 0,05). n>18. Údaje sú zobrazené ako priemer ± SD. nt znamená „netestované“, pretože viac ako 50 % semien nevyklíčilo. (c) Kvantifikácia miery klíčenia ošetrených semien inkubovaných 7 dní v MS médiu s alebo bez 200 μM kumamonamidu a príbuzných zlúčenín. Hviezdičky označujú významné rozdiely oproti simulovanej liečbe (chí-kvadrát test). n=96.
Je zaujímavé, že pridanie alkylových bočných reťazcov dlhších ako C9 znížilo inhibičnú aktivitu, čo naznačuje, že zlúčeniny príbuzné kyseline kumamotovej vyžadujú na prejavenie svojej biologickej aktivity bočné reťazce určitej veľkosti.
Keďže analýza vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou ukázala, že C9 bol modifikovaný na kyselinu ursónovú a nonyloxyderivát kyseliny ursónovej (ďalej len KAND 11) bol najúčinnejším inhibítorom rastu rastlín, vykonali sme podrobnejšiu charakterizáciu KAND 11. Ošetrenie Arabidopsis s 50 μM KAND 11 takmer úplne zabránilo klíčeniu, zatiaľ čo nižšie koncentrácie (40, 30, 20 alebo 10 μM) KAND 11 inhibovali rast koreňov spôsobom závislým od dávky (obr. 4a, b). Aby sme otestovali, či KAND 11 ovplyvňuje životaschopnosť koreňového meristému, skúmali sme koreňové meristémy farbené propídiumjodidom (PI) a merali sme veľkosť plochy meristému. Veľkosť meristému sadeníc pestovaných na médiu obsahujúcom 25 μM KAND-11 bola 151,1 ± 32,5 μm, zatiaľ čo veľkosť meristému sadeníc pestovaných na kontrolnom médiu obsahujúcom DMSO bola 264,7 ± 30,8 μm (obr. 4c, d), čo naznačuje, že KAND-11 obnovuje bunkovú aktivitu. šírenie. Koreňový meristém. V súlade s tým ošetrenie KAND 11 znížilo množstvo signálu markera bunkového delenia CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS v koreňovom meristéme (obr. 4e) 17. Tieto výsledky naznačujú, že KAND 11 inhibuje rast koreňov znížením aktivity bunkovej proliferácie.
Analýza inhibičného účinku derivátov kyseliny urbenonovej (urbenyloxyderiváty) na rast. (a) 7-dňové sadenice divokého typu Col pestované na MS miskách s uvedenými koncentráciami KAND 11. Mierka = 1 cm. (b) Kvantifikácia dĺžky koreňov. Písmená označujú významné rozdiely (Tukeyov HSD test, p< 0,05). n>16. Údaje sú zobrazené ako priemer ± SD. (c) Konfokálna mikroskopia koreňov divokého typu Col farbených propídiumjodidom pestovaných na MS platniach s alebo bez 25 μM KAND 11. Biele zátvorky označujú koreňový meristém. Mierka = 100 µm. (d) Kvantifikácia veľkosti koreňového meristému (n = 10 až 11). Štatistické rozdiely boli stanovené pomocou t-testu (p< 0,05). Stĺpce predstavujú priemernú veľkosť meristému. (e) Mikroskopia diferenciálneho interferenčného kontrastu (DIC) koreňového meristému obsahujúceho konštrukt CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS farbené a farbené na 5-dňových sadenícach pestovaných na MS platniach s alebo bez 25 µM KAND testu.
Fytotoxicita KAND 11 bola ďalej testovaná s použitím ďalšej dvojklíčnolistovej rastliny, tabaku (Nicotiana tabacum), a hlavného modelového organizmu suchozemskej rastliny, pečeňovky (Marchantia polymorpha). Rovnako ako v prípade Arabidopsis, sadenice tabaku SR-1 pestované na médiu obsahujúcom 25 μM KAND 11 produkovali kratšie korene (obr. 5a). Okrem toho 40 zo 48 semien vyklíčilo na miskách obsahujúcich 200 μM KAND 11, zatiaľ čo všetkých 48 semien vyklíčilo na kontrolne ošetrenom médiu, čo naznačuje, že vyššie koncentrácie KAND boli významné (p< 0,05; chí test - štvorcový) inhiboval klíčenie tabaku. (Obr. 5b). Okrem toho, koncentrácia KAND 11, ktorá inhibovala rast baktérií v pečeňovke, bola podobná účinnej koncentrácii v Arabidopsis (Obr. 5c). Tieto výsledky naznačujú, že KAND 11 môže inhibovať rast rôznych rastlín. Následne sme skúmali možnú cytotoxicitu zlúčenín príbuzných s monoamidmi medveďov v iných organizmoch, konkrétne v ľudských bunkách HeLa a kmeni Escherichia coli DH5α, ako zástupcoch vyšších živočíšnych a bakteriálnych buniek. V sérii testov bunkovej proliferácie sme pozorovali, že kumamonamid 1, kyselina kumamonamidová 6 a KAND 11 neovplyvnili rast buniek HeLa ani E. coli pri koncentráciách 100 μM (Obr. 5d,e).
Inhibícia rastu KAND 11 v organizmoch iných ako Arabidopsis. (a) Dvojtýždňové sadenice tabaku divokého typu SR-1 boli pestované na vertikálne umiestnených MS miskách obsahujúcich 25 μM KAND 11. (b) Dvojtýždňové sadenice tabaku divokého typu SR-1 boli pestované na horizontálne umiestnených MS miskách obsahujúcich 200 μM KAND 11. (c) Dvojtýždňové púčiky pečeňovky divokého typu Tak-1 pestované na miskách Gamborg B5 s uvedenými koncentráciami KAND 11. Červené šípky označujú spóry, ktoré prestali rásť počas dvojtýždňovej inkubačnej doby. (d) Test proliferácie buniek HeLa. Počet životaschopných buniek bol meraný v pevných časových intervaloch pomocou súpravy na počítanie buniek 8 (Dojindo). Ako kontrola boli bunky HeLa ošetrené 5 μg/ml aktinomycínu D (Act D), ktorý inhibuje transkripciu RNA polymerázy a spôsobuje bunkovú smrť. Analýzy boli vykonané v troch opakovaniach. (e) Test proliferácie buniek E. coli. Rast E. coli bol analyzovaný meraním OD600. Ako kontrola boli bunky ošetrené 50 μg/ml ampicilínu (Amp), ktorý inhibuje syntézu bakteriálnych bunkových stien. Analýzy boli vykonané v troch opakovaniach.
Aby sme rozlúštili mechanizmus účinku cytotoxicity spôsobenej zlúčeninami príbuznými uramidu, znovu sme analyzovali deriváty kyseliny urbénovej so stredne silnými inhibičnými účinkami, ako je znázornené na obrázku. Ako je znázornené na obrázkoch 2b, 6a, sadenice pestované na agarových platniach obsahujúcich vysoké koncentrácie (200 μM) kyseliny urmotónovej 6 produkovali kratšie a doľava zakrivené korene (θ = – 23,7 ± 6,1), zatiaľ čo sadenice pestované na kontrolnom médiu produkovali takmer rovné korene (θ = – 3,8 ± 7,1). Je známe, že tento charakteristický šikmý rast je výsledkom dysfunkcie kortikálnych mikrotubulov14,18. V súlade s týmto zistením liečivá destabilizujúce mikrotubuly disopyramid a oryzalín indukovali podobné naklonenie koreňov za našich rastových podmienok (obr. 2b, 6a). Zároveň sme testovali deriváty kyseliny urmotónovej a vybrali sme niekoľko z nich, ktoré pri určitých koncentráciách indukovali šikmý rast koreňov. Zlúčeniny 8, 9 a 15 zmenili smer rastu koreňov pri 75 μM, 50 μM a 40 μM, čo naznačuje, že tieto zlúčeniny dokážu účinne destabilizovať mikrotubuly (obr. 2b, 6a). Testovali sme aj najúčinnejší derivát kyseliny ursolovej, KAND 11, pri nižšej koncentrácii (15 µM) a zistili sme, že aplikácia KAND 11 inhibovala rast koreňov a že smer rastu koreňov bol nerovnomerný, hoci mali tendenciu sa zvažovať doľava (obrázok C3). Keďže vyššie koncentrácie liečiv destabilizujúcich mikrotubuly niekedy skôr inhibujú rast rastlín, než aby spôsobovali nakláňanie koreňov, následne sme posúdili možnosť, že KAND 11 ovplyvňuje mikrotubuly, pozorovaním kortikálnych mikrotubulov v epidermálnych bunkách koreňov. Imunohistochémia s použitím protilátok proti β-tubulínu v epidermálnych bunkách koreňov sadeníc ošetrených 25 μM KAND 11 ukázala zmiznutie takmer všetkých kortikálnych mikrotubulov v epidermálnych bunkách v elongačnej zóne (obr. 6b). Tieto výsledky naznačujú, že kyselina kumamotónová a jej deriváty pôsobia priamo alebo nepriamo na mikrotubuly, čím ich narúšajú, a že tieto zlúčeniny sú novými inhibítormi mikrotubulov.
Kyselina ursonová a jej deriváty menia kortikálne mikrotubuly u Arabidopsis thaliana. (a) Uhol sklonu koreňa meraný v prítomnosti rôznych derivátov kyseliny urmotonovej v uvedených koncentráciách. Analyzovali sa aj účinky dvoch zlúčenín, o ktorých je známe, že inhibujú mikrotubuly: disopyramid a oryzalín. Vložka zobrazuje štandard použitý na meranie uhla rastu koreňov. Hviezdičky označujú významné rozdiely oproti simulovanej liečbe (t-test, p< 0,05). n>19. Mierka = 1 cm. (b) Kortikálne mikrotubuly v epidermálnych bunkách v elongačnej zóne. Mikrotubuly v koreňoch divokého typu Arabidopsis Col pestovaných na MS platniach s alebo bez 25 μM KAND 11 boli vizualizované imunohistochemickým farbením s použitím primárnych protilátok proti β-tubulínu a sekundárnych protilátok konjugovaných s Alexa Fluor. Mierka = 10 µm. (c) Mitotická štruktúra mikrotubulov v koreňovom meristéme. Mikrotubuly boli vizualizované imunohistochemickým farbením. Mitotické štruktúry vrátane profázových zón, vretienok a fragmoplastov boli spočítané z konfokálnych snímok. Šípky označujú mitotické štruktúry mikrotubulov. Hviezdičky označujú významné rozdiely oproti simulovanej liečbe (t-test, p< 0,05). n>9. Mierka = 50 µm.
Hoci má Ursa schopnosť narušiť funkciu mikrotubulov, očakáva sa, že jej mechanizmus účinku sa bude líšiť od typických činidiel depolymerizujúcich mikrotubuly. Napríklad vyššie koncentrácie činidiel depolymerizujúcich mikrotubuly, ako je disopyramid a oryzalín, indukujú anizotropnú expanziu epidermálnych buniek, zatiaľ čo KAND 11 nie. Okrem toho spoločná aplikácia KAND 11 a disopyramidu viedla ku kombinovanej disopyramidom indukovanej rastovej odpovedi koreňov a bola pozorovaná inhibícia rastu indukovaná KAND 11 (obr. S4). Analyzovali sme tiež odpoveď hypersenzitívneho mutanta disopyramid 1-1 (phs1-1) na KAND 11. phs1-1 má nekanonickú bodovú mutáciu tubulínkinázy a pri ošetrení disopyramidom produkuje kratšie korene9,20. Sadenice mutanta phs1-1 pestované na agarovom médiu obsahujúcom KAND 11 mali kratšie korene podobné tým, ktoré pestovali na disopyramide (obr. S5).
Okrem toho sme v koreňovom meristéme sadeníc ošetrených KAND 11 pozorovali mitotické mikrotubulové štruktúry, ako sú profázové zóny, vretienka a fragmoplasty. V súlade s pozorovaniami pre CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS sa pozoroval významný pokles počtu mitotických mikrotubulov (obr. 6c).
Aby sme charakterizovali cytotoxicitu KAND 11 pri subcelulárnom rozlíšení, ošetrili sme suspenzné bunky tabakového BY-2 pomocou KAND 11 a pozorovali sme ich reakciu. Najprv sme pridali KAND 11 k bunkám BY-2 exprimujúcim TagRFP-TUA6, ktorý fluorescenčne značí mikrotubuly, aby sme posúdili účinok KAND 11 na kortikálne mikrotubuly. Hustota kortikálnych mikrotubulov bola hodnotená pomocou analýzy obrazu, ktorá kvantifikovala percento cytoskeletálnych pixelov medzi cytoplazmatickými pixelmi. Výsledky testu ukázali, že po ošetrení s 50 μM alebo 100 μM KAND 11 počas 1 hodiny sa hustota významne znížila na 0,94 ± 0,74 %, respektíve 0,23 ± 0,28 %, zatiaľ čo hustota buniek ošetrených DMSO dosiahla 1,61 ± 0,34 % (obr. 7a). Tieto výsledky sú v súlade s pozorovaním u Arabidopsis, že ošetrenie KAND 11 indukuje depolymerizáciu kortikálnych mikrotubulov (obr. 6b). Taktiež sme skúmali líniu BY-2 s aktínovými filamentmi značenými GFP-ABD po ošetrení rovnakou koncentráciou KAND 11 a pozorovali sme, že ošetrenie KAND 11 narušilo aktínové filamenty. Ošetrenie 50 μM alebo 100 μM KAND 11 počas 1 hodiny významne znížilo hustotu aktínových filamentov na 1,20 ± 0,62 %, respektíve 0,61 ± 0,26 %, zatiaľ čo hustota v bunkách ošetrených DMSO bola 1,69 ± 0,51 % (obr. 2). 7b). Tieto výsledky sú v kontraste s účinkami propyzamidu, ktorý neovplyvňuje aktínové filamenty, a latrunkulínu B, depolymerizátora aktínu, ktorý neovplyvňuje mikrotubuly (obrázok SI S6). Okrem toho ošetrenie kumamonamidom 1, kyselinou kumamonamidovou 6 alebo KAND 11 neovplyvnilo mikrotubuly v bunkách HeLa (obrázok SI S7). Predpokladá sa teda, že mechanizmus účinku KAND 11 sa líši od mechanizmu známych disruptorov cytoskeletu. Okrem toho naše mikroskopické pozorovanie buniek BY-2 ošetrených KAND 11 odhalilo nástup bunkovej smrti počas ošetrenia KAND 11 a ukázalo, že podiel mŕtvych buniek zafarbených Evansovou modrou sa po 30 minútach ošetrenia KAND 11 významne nezvýšil, zatiaľ čo po 90 minútach ošetrenia 50 μM alebo 100 μM KAND sa počet mŕtvych buniek zvýšil na 43,7 %, respektíve 80,1 % (obr. 7c). Tieto údaje spolu naznačujú, že nový derivát kyseliny ursolovej KAND 11 je rastlinne špecifický inhibítor cytoskeletu s doteraz neznámym mechanizmom účinku.
KAND ovplyvňuje kortikálne mikrotubuly, aktínové filamenty a životaschopnosť tabakových buniek BY-2. (a) Vizualizácia kortikálnych mikrotubulov v bunkách BY-2 v prítomnosti TagRFP-TUA6. Bunky BY-2 ošetrené KAND 11 (50 μM alebo 100 μM) alebo DMSO boli skúmané konfokálnou mikroskopiou. Hustota kortikálnych mikrotubulov bola vypočítaná z mikrofotografií 25 nezávislých buniek. Písmená označujú významné rozdiely (Tukeyov HSD test, p< 0,05). Mierka = 10 µm. (b) Kortikálne aktínové filamenty v bunkách BY-2 vizualizované v prítomnosti GFP-ABD2. Bunky BY-2 ošetrené KAND 11 (50 μM alebo 100 μM) alebo DMSO boli skúmané konfokálnou mikroskopiou. Hustota kortikálnych aktínových filamentov bola vypočítaná z mikrofotografií 25 nezávislých buniek. Písmená označujú významné rozdiely (Tukeyho HSD test, p< 0,05). Mierka = 10 µm. (c) Pozorovanie mŕtvych buniek BY-2 farbením Evansovou modrou. Bunky BY-2 ošetrené KAND 11 (50 μM alebo 100 μM) alebo DMSO boli vyšetrené mikroskopiou v jasnom poli. n = 3. Mierka = 100 µm.
Objav a aplikácia nových prírodných produktov viedli k významnému pokroku v rôznych aspektoch ľudského života vrátane medicíny a poľnohospodárstva. Historický výskum sa uskutočnil s cieľom získať užitočné zlúčeniny z prírodných zdrojov. Najmä aktinomycéty sú známe ako užitočné antiparazitické antibiotiká pre nematódy vďaka svojej schopnosti produkovať rôzne sekundárne metabolity, ako je avermektín, hlavná zlúčenina ivermektínu, a bleomycín a jeho deriváty, ktoré sa v medicíne používajú ako protirakovinové činidlo21,22. Podobne bolo z aktinomycétov objavených množstvo herbicídnych zlúčenín, z ktorých niektoré sa už komerčne používajú1,23. Preto sa analýza metabolitov aktinomycétov s cieľom izolovať prírodné produkty s požadovanými biologickými aktivitami považuje za účinnú stratégiu. V tejto štúdii sme objavili novú zlúčeninu, kumamonamid, zo S. werraensis a úspešne sme ju syntetizovali. Kyselina ursónová je syntetický medziprodukt urbenamidu a jeho derivátov. Môže spôsobiť charakteristické kučeravosť koreňov, vykazovať strednú až silnú herbicídnu aktivitu a priamo alebo nepriamo poškodzovať rastlinné mikrotubuly. Mechanizmus účinku kyseliny urmotónovej sa však môže líšiť od mechanizmu existujúcich inhibítorov mikrotubulov, pretože KAND 11 tiež narúša aktínové filamenty a spôsobuje bunkovú smrť, čo naznačuje regulačný mechanizmus, ktorým kyselina urmotónová a jej deriváty ovplyvňujú širokú škálu cytoskeletálnych štruktúr.
Ďalšia detailná charakterizácia kyseliny urbónovej pomôže lepšie pochopiť mechanizmus účinku kyseliny urbónovej. Ďalším cieľom je najmä vyhodnotiť schopnosť kyseliny ursónovej viazať sa na redukované mikrotubuly, aby sa určilo, či kyselina ursónová a jej deriváty pôsobia priamo na mikrotubuly a depolymerizujú ich, alebo či ich pôsobenie vedie k destabilizácii mikrotubulov. Okrem toho, v prípade, že mikrotubuly nie sú priamym cieľom, identifikácia miesta účinku a molekulárnych cieľov kyseliny ursónovej na rastlinných bunkách pomôže lepšie pochopiť vlastnosti príbuzných zlúčenín a možné spôsoby zlepšenia herbicídnej aktivity. Náš test bioaktivity odhalil jedinečnú cytotoxickú schopnosť kyseliny ursónovej na rast rastlín, ako je Arabidopsis thaliana, tabak a pečeňovka, pričom ani bunky E. coli, ani bunky HeLa neboli ovplyvnené. Malá alebo žiadna toxicita pre živočíšne bunky je výhodou derivátov kyseliny ursónovej, ak sa vyvíjajú ako herbicídy na použitie na otvorených poľnohospodárskych poliach. Keďže mikrotubuly sú bežnými štruktúrami v eukaryotoch, ich selektívna inhibícia v rastlinách je kľúčovou požiadavkou na herbicídy. Napríklad propyzamid, činidlo depolymerizujúce mikrotubuly, ktoré sa priamo viaže na tubulín a inhibuje polymerizáciu, sa používa ako herbicíd kvôli svojej nízkej toxicite pre živočíšne bunky24. Na rozdiel od disopyramidu majú príbuzné benzamidy odlišnú cieľovú špecificitu. Okrem rastlinných mikrotubulov inhibuje RH-4032 alebo benzoxamid aj mikrotubuly živočíšnych buniek alebo oomycétov a zalilamid sa používa ako fungicíd kvôli svojej nízkej fytotoxicite25,26,27. Novoobjavený medvedík a jeho deriváty vykazujú selektívnu cytotoxicitu voči rastlinám, ale stojí za zmienku, že ďalšie modifikácie môžu zmeniť ich cieľovú špecificitu, čo potenciálne poskytuje ďalšie deriváty na kontrolu patogénnych húb alebo oomycétov.
Unikátne vlastnosti kyseliny urbenonovej a jej derivátov sú užitočné pre ich vývoj ako herbicídov a použitie ako výskumných nástrojov. Dôležitosť cytoskeletu pri riadení tvaru rastlinných buniek je všeobecne uznávaná. Skoršie štúdie ukázali, že rastliny vyvinuli komplexné mechanizmy organizácie kortikálnych mikrotubulov riadením dynamiky mikrotubulov, aby správne riadili morfogenézu. Bolo identifikovaných veľké množstvo molekúl zodpovedných za reguláciu aktivity mikrotubulov a súvisiaci výskum stále prebieha3,4,28. Naše súčasné chápanie dynamiky mikrotubulov v rastlinných bunkách úplne nevysvetľuje mechanizmy organizácie kortikálnych mikrotubulov. Napríklad, hoci disopyramid aj oryzalín môžu depolymerizovať mikrotubuly, disopyramid spôsobuje vážne skreslenie koreňov, zatiaľ čo oryzalín má relatívne mierny účinok. Navyše, mutácie v tubulíne, ktorý stabilizuje mikrotubuly, tiež spôsobujú dextrorotáciu v koreňoch, zatiaľ čo paklitaxel, ktorý tiež stabilizuje dynamiku mikrotubulov, to nespôsobuje. Preto by štúdium a identifikácia molekulárnych cieľov kyseliny ursolovej malo poskytnúť nové poznatky o regulácii rastlinných kortikálnych mikrotubulov. Podobne budúce porovnania chemikálií, ktoré účinne podporujú skreslený rast, ako je disopyramid, a menej účinných chemikálií, ako je oryzalín alebo kyselina kumamotorová, poskytnú vodítka k tomu, ako k skreslenému rastu dochádza.
Na druhej strane, obranné prestavby cytoskeletu sú ďalšou možnosťou vysvetlenia cytotoxicity kyseliny ursónovej. Infekcia patogénom alebo zavedenie elicitora do rastlinných buniek niekedy spôsobuje deštrukciu cytoskeletu a následnú bunkovú smrť29. Napríklad, kryptoxantín odvodený z oomycétov, ako sa uvádza, narúša mikrotubuly a aktínové filamenty pred smrťou tabakových buniek, podobne ako sa to deje pri liečbe KAND30,31. Podobnosti medzi obrannými reakciami a bunkovými reakciami vyvolanými kyselinou ursónovou nás viedli k hypotéze, že spúšťajú bežné bunkové procesy, hoci je evidentný rýchlejší a silnejší účinok kyseliny ursónovej ako kryptoxantínu. Štúdie však ukázali, že narušenie aktínových filamentov podporuje spontánnu bunkovú smrť, ktorá nie je vždy sprevádzaná narušením mikrotubulov29. Okrem toho zostáva otázne, či patogén alebo elicitor spôsobuje skreslený rast koreňov, ako to robia deriváty kyseliny ursónovej. Molekulárne poznatky spájajúce obranné reakcie a cytoskelet sú preto atraktívnym problémom, ktorý treba riešiť. Využitím prítomnosti nízkomolekulárnych zlúčenín príbuzných kyseline ursónovej, ako aj radu derivátov s rôznou účinnosťou, môžu poskytnúť príležitosti na zacielenie na neznáme bunkové mechanizmy.
Objav a aplikácia nových zlúčenín, ktoré modulujú dynamiku mikrotubulov, spoločne poskytnú účinné metódy na riešenie komplexných molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom určovania tvaru rastlinných buniek. V tejto súvislosti môže nedávno vyvinutá zlúčenina kyselina urmotonová, ktorá ovplyvňuje mikrotubuly a aktínové filamenty a indukuje bunkovú smrť, poskytnúť príležitosť na dešifrovanie súvislosti medzi kontrolou mikrotubulov a týmito ďalšími mechanizmami. Chemická a biologická analýza s použitím kyseliny urbenonovej nám teda pomôže pochopiť molekulárne regulačné mechanizmy, ktoré riadia cytoskelet rastlín.
Inokulujte S. werraensis MK493-CF1 do 500 ml Erlenmeyerovej banky s prepážkou obsahujúcej 110 ml inokulačného média pozostávajúceho z 2 % (hm./obj.) galaktózy, 2 % (hm./obj.) esenciálnej pasty, 1 % (hm./obj.) Bacto-sójového extraktu (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (hm./obj.) kukuričného extraktu (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonsko), 0,2 % (hm./obj.) (NH4)2SO4 a 0,2 % CaCO3 v deionizovanej vode (pH 7,4 pred sterilizáciou). Inokulačné kultúry boli inkubované na rotačnej trepačke (180 ot./min.) pri teplote 27 °C počas 2 dní. Produkčná kultivácia prostredníctvom fermentácie v pevnom skupenstve. Semenná kultúra (7 ml) sa preniesla do 500 ml banky K-1 obsahujúcej 40 g produkčného média pozostávajúceho z 15 g lisovaného jačmeňa (MUSO Co., Ltd., Japonsko) a 25 g deionizovanej vody (pH sa pred sterilizáciou neupravovalo). Fermentácia sa uskutočňovala pri teplote 30 °C v tme počas 14 dní. Fermentačný materiál sa extrahoval 40 ml/fľaša EtOH a centrifugoval sa (1500 g, 4 °C, 10 min). Supernatant kultúry (60 ml) sa extrahoval zmesou 10 % MeOH/EtOAc. Organická vrstva sa odparila za zníženého tlaku, čím sa získal zvyšok (59,5 mg), ktorý sa podrobil HPLC s gradientovou elúciou (0–10 minút: 90 %) na kolóne s reverznou fázou (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, vnútorný priemer 10 mm × dĺžka 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minút: 90 % H2O/CH3CN až 70 % H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minút: 90 % H2O/EtOH, 45–155 minút: 90 % H2O/EtOH až 100 % EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100 % EtOH) pri prietoku 1,5 ml/min, kumamonamid (1, 36,0 mg) sa izoloval ako biely amorfný prášok.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ vypočítaná hodnota: 141,0659, nameraná hodnota: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Semená Columbia (Col-0) boli získané z Centra biologických zdrojov Arabidopsis (ABRC) s povolením na výskumné použitie. Semená Col-0 boli rozmnožené a udržiavané v našich laboratórnych podmienkach a použité ako rastliny Arabidopsis divokého typu. Semená Arabidopsis boli povrchovo sterilizované a kultivované v polovičnej koncentrácii média Murashige a Skoog obsahujúcom 2 % sacharózy (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (hm./obj.) kyseliny 2-(4-morfolino)etánsulfónovej (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). a 1,5 % agaru (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, pri teplote 23 °C a konštantnom svetle. Semená mutanta phs1-1 poskytol T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Semená kmeňa SR-1 poskytol T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) a použili sa ako rastliny tabaku divokého typu. Tabakové semená boli povrchovo sterilizované a namočené v sterilnej vode na tri noci, aby sa podporilo klíčenie, potom umiestnené do polovičného roztoku obsahujúceho 2 % sacharózy, 0,05 % (hm./obj.) MES a 0,8 % gelánovej gumy (Fujifilm Wako Pure Chemical, Murashige a Skoogovo médium) s pH 5,7 a inkubované pri teplote 23 °C za konštantného svetla.
Kmeň Tak-1 poskytol T. Kohchi (Kyoto University) a bol použitý ako štandardná experimentálna jednotka pre štúdiu pečeňovky. Gemma bola získaná zo sterilizovaných kultivovaných rastlín a potom vysiata na médium Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) obsahujúce 1 % sacharózy a 0,3 % gelánovej gumy a inkubovaná pri teplote 23 °C za nepretržitého svetla.
Tabakové bunky BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) poskytol S. Hasezawa (Univerzita v Tokiu). Bunky BY-2 boli 95-násobne zriedené v modifikovanom médiu Linsmeiera a Skooga a týždenne dopĺňané kyselinou 2,4-dichlórfenoxyoctovou 32. Bunková suspenzia bola miešaná na rotačnej trepačke pri 130 ot./min. pri teplote 27 °C v tme. Bunky boli premyté 10-násobným objemom čerstvého média a resuspendované v rovnakom médiu. Transgénne bunkové línie BY-2 stabilne exprimujúce mikrotubulový marker TagRFP-TUA6 alebo aktínový filamentový marker GFP-ABD2 pod promótorom 35S vírusu mozaiky karfiolu boli vytvorené podľa popisu 33, 34, 35. Tieto bunkové línie je možné udržiavať a synchronizovať pomocou postupov podobných tým, ktoré boli použité pre pôvodnú bunkovú líniu BY-2.
Bunky HeLa boli kultivované v Dulbeccovom modifikovanom Eagleovom médiu (DMEM) (Life Technologies) doplnenom o 10 % fetálneho bovinného séra, 1,2 U/ml penicilínu a 1,2 μg/ml streptomycínu v inkubátore pri teplote 37 °C s 5 % CO2.
Všetky experimenty opísané v tomto rukopise boli vykonané v súlade s japonskými predpismi a smernicami o biologickej bezpečnosti.
Zlúčeniny boli rozpustené v dimetylsulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ako zásobné roztoky a zriedené v MS médiu pre Arabidopsis a tabak alebo v médiu Gamborg B5 pre pečeňovku. Pre test inhibície rastu koreňov bolo viac ako 10 semien na misku zasiatych na agarové médium obsahujúce uvedené zlúčeniny alebo DMSO. Semená boli inkubované v rastovej komore počas 7 dní. Sadenice boli odfotografované a bola zmeraná dĺžka koreňov. Pre test klíčivosti Arabidopsis bolo 48 semien na misku zasiatych na agarové médium obsahujúce 200 μM zlúčeniny alebo DMSO. Semená Arabidopsis boli pestované v rastovej komore a počet vyklíčených sadeníc bol spočítaný 7 dní po vyklíčení (dag). Pre test klíčivosti tabaku bolo 24 semien na misku zasiatych na agarové médium obsahujúce 200 μM KAND alebo DMSO. Semená tabaku boli pestované v rastovej komore a počet vyklíčených sadeníc bol spočítaný po 14 dňoch. Pre test inhibície rastu pečeňovky sa 9 embryí z každej platne umiestnilo na agarové médium obsahujúce uvedené koncentrácie KAND alebo DMSO a inkubovalo sa v rastovej komore počas 14 dní.
Na vizualizáciu organizácie koreňového meristému použite sadenice zafarbené 5 mg/ml propídiumjodidu (PI). Signály PI boli pozorované fluorescenčnou mikroskopiou s použitím konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopu TCS SPE (Leica Microsystems).
Histochemické farbenie koreňov β-glukuronidázou (GUS) sa uskutočnilo podľa protokolu opísaného Malamim a Benfeyom36. Sadenice sa fixovali cez noc v 90 % acetóne, farbili sa 0,5 mg/ml kyseliny 5-bróm-4-chlór-3-indolyl-β-d-glukurónovej v GUS pufri počas 1 hodiny a umiestnili sa do hydratovaného roztoku chloraldehydu (8 g chloralhydrátu, 2 ml vody a 1 ml glycerolu) a pozorovali sa diferenciálnou interferenčnou kontrastnou mikroskopiou s použitím mikroskopu Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Uhly koreňov boli merané na 7-dňových sadenícach pestovaných na vertikálne umiestnených platniach. Uhol koreňa odmerajte od smeru vektora gravitácie podľa popisu v kroku 6.
Usporiadanie kortikálnych mikrotubulov bolo pozorované podľa popisu, s menšími úpravami protokolu 37. Ako primárne a sekundárne protilátky boli použité protilátky proti β-tubulínu (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) a protilátky proti myšiemu IgG konjugované s Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) v riedení 1:1000 a 1:100. Fluorescenčné snímky boli získané pomocou konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopu TCS SPE (Leica Microsystems). Získajte Z-stack snímky a vytvorte projekcie maximálnej intenzity podľa pokynov výrobcu.
Test proliferácie buniek HeLa sa uskutočnil s použitím súpravy Cell Counting Kit 8 (Dojindo) podľa pokynov výrobcu.
Rast E. coli DH5α sa analyzoval meraním hustoty buniek v kultúre pomocou spektrofotometra pri 600 nm (OD600).
Organizácia cytoskeletu v transgénnych bunkách BY-2 bola pozorovaná pomocou fluorescenčného mikroskopu vybaveného konfokálnym skenovacím zariadením CSU-X1 (Yokogawa) a sCMOS kamerou (Zyla, Andor Technology). Hustota cytoskeletu bola hodnotená analýzou obrazu, ktorá kvantifikovala percento cytoskeletálnych pixelov medzi cytoplazmatickými pixelmi v konfokálnych obrazoch pomocou softvéru ImageJ, ako je opísané38,39.
Na detekciu bunkovej smrti v bunkách BY-2 sa alikvotná časť bunkovej suspenzie inkubovala s 0,05 % Evansovou modrou počas 10 minút pri izbovej teplote. Selektívne farbenie mŕtvych buniek Evansovou modrou závisí od extrúzie farbiva z životaschopných buniek intaktnou plazmatickou membránou40. Zafarbené bunky sa pozorovali pomocou mikroskopu s jasným poľom (BX53, Olympus).
Bunky HeLa boli pestované v DMEM doplnenom o 10 % FBS vo zvlhčenom inkubátore pri teplote 37 °C a 5 % CO2. Bunky boli ošetrené 100 μM KAND 11, kyselinou kumamonámovou 6, kumamonamidom 1, 100 ng/ml kolcemidu (Gibco) alebo 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) počas 6 hodín pri teplote 37 °C. Bunky boli fixované MetOH počas 10 minút a potom acetátom počas 5 minút pri izbovej teplote. Fixované bunky boli inkubované s primárnou protilátkou proti β-tubulínu (1D4A4, Proteintech: 66240-1) zriedenou v 0,5 % BSA/PBS počas 2 hodín, 3-krát premyté TBST a potom inkubované s kozou protilátkou Alexa Fluor. 488 počas 1 hodiny. – Myší IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) a 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) zriedeného v 0,5 % BSA/PBS. Po trojnásobnom premytí TBST boli zafarbené bunky pozorované na inverznom mikroskope Nikon Eclipse Ti-E. Snímky boli zachytené chladenou CCD kamerou Hamamatsu ORCA-R2 pomocou softvéru MetaMorph (Molecular Devices).
Čas uverejnenia: 17. júna 2024