Háďa borovicové je karanténny migrujúci endoparazit, o ktorom je známe, že spôsobuje vážne ekonomické straty v ekosystémoch borovicových lesov. Táto štúdia skúma nematocídnu aktivitu halogénovaných indolov proti háďatkám borovicovým a ich mechanizmus účinku. Nematocídna aktivita 5-jódindolu a avermektínu (pozitívna kontrola) proti háďatkám borovicovým bola podobná a vysoká pri nízkych koncentráciách (10 μg/ml). 5-jódindol znížil plodnosť, reprodukčnú aktivitu, embryonálnu a larválnu úmrtnosť a lokomotorické správanie. Molekulárne interakcie ligandov s receptormi chloridových kanálov riadených glutamátom špecifickými pre bezstavovce podporujú myšlienku, že 5-jódindol, podobne ako avermektín, sa pevne viaže na aktívne miesto receptora. 5-jódindol tiež indukoval rôzne fenotypové deformácie u háďatiek, vrátane abnormálneho kolapsu/zmenšovania orgánov a zvýšenej vakuolizácie. Tieto výsledky naznačujú, že vakuoly môžu hrať úlohu v úmrtí sprostredkovanom metyláciou háďatiek. Dôležité je, že 5-jódindol nebol toxický pre oba druhy rastlín (kapustu a reďkovku). Táto štúdia teda dokazuje, že aplikácia jódindolu v podmienkach prostredia môže kontrolovať poškodenie borovicovým vädnutím.
Háďatko borovicové (Bursaphelenchus xylophilus) patrí k háďatkám borovicovým (PWN), migrujúcim endoparazitickým háďatkám, o ktorých je známe, že spôsobujú vážne ekologické škody na ekosystémoch borovicových lesov1. Vädnutie borovice (PWD) spôsobené háďatkom borovicovým sa stáva vážnym problémom na niekoľkých kontinentoch vrátane Ázie a Európy a v Severnej Amerike háďatko ničí introdukované druhy borovíc1,2. Úbytok borovíc je hlavným ekonomickým problémom a vyhliadky na jeho globálne šírenie sú znepokojujúce3. Háďatko najčastejšie napáda tieto druhy borovíc: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii a Pinus radiata4. Háďatko borovicové je závažné ochorenie, ktoré môže borovice zničiť v priebehu týždňov alebo mesiacov od infekcie. Okrem toho sú ohniská háďatka borovicového bežné v rôznych ekosystémoch, takže sa vytvorili pretrvávajúce infekčné reťazce1.
Bursaphelenchus xylophilus je karanténny rastlinný parazitický háďatko patriaci do nadčeľade Aphelenchoidea a kladu 102.5. Háďatko sa živí hubami a rozmnožuje sa v drevných tkanivách borovíc, pričom sa vyvíja do štyroch rôznych larválnych štádií: L1, L2, L3, L4 a dospelého jedinca1,6. V podmienkach nedostatku potravy prechádza borovicové háďatko do špecializovaného larválneho štádia – dauer, ktoré parazituje na svojom prenášači – lykožrútovi borovicovom (Monochamus alternatus) a prenáša sa na zdravé borovice. U zdravých hostiteľov háďatká rýchlo migrujú cez rastlinné tkanivá a živia sa parenchymatóznymi bunkami, čo vedie k množstvu reakcií z precitlivenosti, vädnutiu a úhynu borovice do jedného roka po infekcii1,7,8.
Biologická kontrola borovicových háďatiek je už dlho výzvou, pričom karanténne opatrenia siahajú až do 20. storočia. Súčasné stratégie kontroly borovicových háďatiek zahŕňajú predovšetkým chemické ošetrenia vrátane fumigácie dreva a implantácie nematocídov do kmeňov stromov. Najčastejšie používanými nematocídmi sú avermektín a avermektín benzoát, ktoré patria do čeľade avermektínov. Tieto drahé chemikálie sú vysoko účinné proti mnohým druhom háďatiek a považujú sa za bezpečné pre životné prostredie9. Očakáva sa však, že opakované používanie týchto nematocídov vytvorí selekčný tlak, ktorý takmer určite povedie k vzniku rezistentných borovicových háďatiek, ako sa preukázalo u niekoľkých hmyzích škodcov, ako sú Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella a háďatká Trichostrongylus colubriformis a Ostertagia circumcincta, ktoré si postupne vyvinuli rezistenciu voči avermektínom10,11,12. Preto je potrebné pravidelne skúmať vzorce rezistencie a priebežne testovať nematocídy, aby sa našli alternatívne, nákladovo efektívne a ekologické opatrenia na kontrolu PVD. V posledných desaťročiach viacerí autori navrhli použitie rastlinných extraktov, esenciálnych olejov a prchavých látok ako činidiel na kontrolu háďatiek13,14,15,16.
Nedávno sme preukázali nematocídnu aktivitu indolu, medzibunkovej a medziríšskej signálnej molekuly, u Caenorhabditis elegans 17. Indol je rozšírený intracelulárny signál v mikrobiálnej ekológii, ktorý riadi početné funkcie ovplyvňujúce mikrobiálnu fyziológiu, tvorbu spór, stabilitu plazmidov, rezistenciu na liečivá, tvorbu biofilmu a virulenciu 18, 19. Aktivita indolu a jeho derivátov proti iným patogénnym nematódom nebola skúmaná. V tejto štúdii sme skúmali nematocídnu aktivitu 34 indolov proti háďatkám borovicovým a objasnili mechanizmus účinku najúčinnejšieho 5-jódindolu pomocou mikroskopie, časozbernej fotografie a molekulárnych dokovacích experimentov a hodnotili sme jeho toxické účinky na rastliny pomocou testu klíčenia semien.
Vysoké koncentrácie (> 1,0 mM) indolu už predtým preukázali nematocídny účinok na háďatká17. Po ošetrení B. xylophilus (zmiešané životné štádiá) indolom alebo 33 rôznymi derivátmi indolu v koncentrácii 1 mM sa mortalita B. xylophilus merala spočítaním živých a mŕtvych háďatiek v kontrolnej a ošetrenej skupine. Päť indolov vykazovalo významnú nematocídnu aktivitu; prežitie neošetrenej kontrolnej skupiny bolo po 24 hodinách 95 ± 7 %. Z 34 testovaných indolov spôsobili 5-jódindol a 4-fluórindol v koncentrácii 1 mM 100 % mortalitu, zatiaľ čo 5,6-difluórindigo, metylindol-7-karboxylát a 7-jódindol spôsobili približne 50 % mortalitu (Tabuľka 1).
Vplyv 5-jódindolu na tvorbu vakuol a metabolizmus háďatka borovicového. (A) Vplyv avermektínu a 5-jódindolu na dospelé samce háďatiek, (B) vajíčka háďatka v štádiu L1 a (C) metabolizmus B. xylophilus, (i) vakuoly neboli pozorované v čase 0 h, ošetrenie viedlo k (ii) vakuolám, (iii) akumulácii viacerých vakuol, (iv) opuchu vakuol, (v) fúzii vakuol a (vi) tvorbe obrovských vakuol. Červené šípky označujú opuch vakuol, modré šípky označujú fúziu vakuol a čierne šípky označujú obrovské vakuoly. Mierka = 50 μm.
Okrem toho táto štúdia opísala aj sekvenčný proces úmrtia indukovaného metánom u borovicových háďatiek (obrázok 4C). Metanogénna smrť je neapoptotický typ bunkovej smrti spojený s akumuláciou prominentných cytoplazmatických vakuol27. Morfologické defekty pozorované u borovicových háďatiek sa zdajú byť úzko spojené s mechanizmom úmrtia indukovaného metánom. Mikroskopické vyšetrenie v rôznych časoch ukázalo, že po 20 hodinách vystavenia 5-jódindolu (0,1 mM) sa vytvorili obrovské vakuoly. Mikroskopické vakuoly boli pozorované po 8 hodinách ošetrenia a ich počet sa zvýšil po 12 hodinách. Po 14 hodinách bolo pozorovaných niekoľko veľkých vakuol. Po 12 – 16 hodinách ošetrenia bolo jasne viditeľných niekoľko zlúčených vakuol, čo naznačuje, že fúzia vakuol je základom mechanizmu metanogénnej smrti. Po 20 hodinách bolo v celom červe nájdených niekoľko obrovských vakuol. Tieto pozorovania predstavujú prvú správu o metuóze u C. elegans.
U červov ošetrených 5-jódindolom sa pozorovala aj agregácia a prasknutie vakuol (obr. 5), o čom svedčí ohýbanie červov a uvoľňovanie vakuol do prostredia. Narušenie vakuol sa pozorovalo aj v membráne vaječnej škrupiny, ktorá je počas liahnutia normálne zachovaná neporušená enzýmom L2 (doplnkový obr. S2). Tieto pozorovania podporujú účasť akumulácie tekutín a zlyhania osmoregulácie, ako aj reverzibilného poškodenia buniek (RCI), na procese tvorby a hnisania vakuol (obr. 5).
S hypotézou o úlohe jódu v pozorovanej tvorbe vakuol sme skúmali nematocídnu aktivitu jodidu sodného (NaI) a jodidu draselného (KI). Avšak pri koncentráciách (0,1, 0,5 alebo 1 mM) neovplyvnili ani prežitie nematód, ani tvorbu vakuol (doplnkový obrázok S5), hoci 1 mM KI mal mierny nematocídny účinok. Na druhej strane, 7-jódindol (1 alebo 2 mM), podobne ako 5-jódindol, indukoval viacnásobné vakuoly a štrukturálne deformácie (doplnkový obrázok S6). Tieto dva jódindoly vykazovali podobné fenotypové vlastnosti u borovicových nematód, zatiaľ čo NaI a KI nie. Je zaujímavé, že indol pri testovaných koncentráciách neindukoval tvorbu vakuol u B. xylophilus (údaje nie sú uvedené). Výsledky teda potvrdili, že za vakuolizáciu a metabolizmus B. xylophilus je zodpovedný komplex indol-jód.
Spomedzi indolov testovaných na nematocídnu aktivitu mal 5-jódindol najvyšší index sklzu -5,89 kcal/mol, nasledovaný 7-jódindolom (-4,48 kcal/mol), 4-fluórindolom (-4,33) a indolom (-4,03) (obrázok 6). Silná vodíková väzba 5-jódindolu s leucínom 218 v hlavnom reťazci stabilizuje jeho väzbu, zatiaľ čo všetky ostatné deriváty indolu sa viažu na serín 260 prostredníctvom vodíkových väzieb v bočnom reťazci. Medzi inými modelovanými jódindolmi má 2-jódindol väzbovú hodnotu -5,248 kcal/mol, čo je spôsobené jeho hlavnou vodíkovou väzbou s leucínom 218. Medzi ďalšie známe väzby patrí 3-jódindol (-4,3 kcal/mol), 4-jódindol (-4,0 kcal/mol) a 6-fluórindol (-2,6 kcal/mol) (doplnkový obrázok S8). Väčšina halogénovaných indolov a samotný indol, s výnimkou 5-jódindolu a 2-jódindolu, tvoria väzbu so serínom 260. Skutočnosť, že vodíková väzba s leucínom 218 svedčí o účinnej väzbe receptor-ligand, ako bolo pozorované pri ivermektíne (doplnkový obrázok S7), potvrdzuje, že 5-jódindol a 2-jódindol, podobne ako ivermektín, sa pevne viažu na aktívne miesto receptora GluCL prostredníctvom leucínu 218 (obr. 6 a doplnkový obrázok S8). Predpokladáme, že táto väzba je potrebná na udržanie otvorenej pórovitej štruktúry komplexu GluCL a že pevnou väzbou na aktívne miesto receptora GluCL 5-jódindol, 2-jódindol, avermektín a ivermektín tak udržiavajú iónový kanál otvorený a umožňujú príjem tekutín.
Molekulárne prepojenie indolu a halogénovaného indolu s GluCL. Väzbové orientácie ligandov (A) indolu, (B) 4-fluórindolu, (C) 7-jódindolu a (D) 5-jódindolu s aktívnym miestom GluCL. Proteín je znázornený pásikom a vodíkové väzby v hlavnom reťazci sú znázornené ako žlté bodkované čiary. (A′), (B′), (C′) a (D′) znázorňujú interakcie zodpovedajúcich ligandov s okolitými aminokyselinovými zvyškami a vodíkové väzby v bočných reťazcoch sú označené ružovými bodkovanými šípkami.
Boli vykonané experimenty na vyhodnotenie toxického účinku 5-jódindolu na klíčenie semien kapusty a reďkovky. 5-jódindol (0,05 alebo 0,1 mM) alebo avermektín (10 μg/ml) mali malý alebo žiadny vplyv na počiatočné klíčenie a vzchádzanie rastlín (obrázok 7). Okrem toho sa nezistil žiadny významný rozdiel medzi mierou klíčenia neošetrených kontrolných semien a semien ošetrených 5-jódindolom alebo avermektínom. Vplyv na predĺženie tabového koreňa a počet vytvorených bočných koreňov bol nevýznamný, hoci 1 mM (10-násobok jeho účinnej koncentrácie) 5-jódindolu mierne oneskoril vývoj bočných koreňov. Tieto výsledky naznačujú, že 5-jódindol je netoxický pre rastlinné bunky a pri skúmaných koncentráciách neinterferuje s procesmi vývoja rastlín.
Vplyv 5-jódindolu na klíčenie semien. Klíčenie, klíčenie a laterálne zakorenenie semien B. oleracea a R. raphanistrum na agarovom médiu Murashige a Skoog s alebo bez avermektínu alebo 5-jódindolu. Klíčenie bolo zaznamenané po 3 dňoch inkubácie pri teplote 22 °C.
Táto štúdia uvádza niekoľko prípadov usmrcovania nematód indolmi. Dôležité je, že ide o prvú správu o tom, že jódindol indukuje metyláciu (proces spôsobený hromadením malých vakuol, ktoré sa postupne spájajú do obrovských vakuol, čo nakoniec vedie k prasknutiu membrány a jej smrti) v ihličí borovice, pričom jódindol vykazuje významné nematocídne vlastnosti podobné vlastnostiam komerčného nematocídu avermektínu.
Bolo už skôr hlásené, že indoly vykonávajú viacero signálnych funkcií v prokaryotoch a eukaryotoch, vrátane inhibície/tvorby biofilmu, prežitia baktérií a patogenity19,32,33,34. Nedávno potenciálne terapeutické účinky halogénovaných indolov, indolových alkaloidov a polosyntetických derivátov indolu pritiahli rozsiahly výskumný záujem35,36,37. Napríklad sa ukázalo, že halogénované indoly ničia perzistentné bunky Escherichia coli a Staphylococcus aureus37. Okrem toho je vedecky zaujímavé študovať účinnosť halogénovaných indolov proti iným druhom, rodom a ríšam a táto štúdia je krokom k dosiahnutiu tohto cieľa.
V tejto práci navrhujeme mechanizmus úmrtnosti vyvolanej 5-jódindolom u C. elegans, ktorý je založený na reverzibilnom poškodení buniek (RCI) a metylácii (obrázky 4C a 5). Edémové zmeny, ako je opuch a vakuolárna degenerácia, sú indikátormi RCI a metylácie, ktoré sa prejavujú ako obrovské vakuoly v cytoplazme48,49. RCI narúša produkciu energie znížením produkcie ATP, čo spôsobuje zlyhanie ATPázovej pumpy alebo narúša bunkové membrány a spôsobuje rýchly prítok Na+, Ca2+ a vody50,51,52. Intracytoplazmatické vakuoly vznikajú v živočíšnych bunkách v dôsledku akumulácie tekutiny v cytoplazme v dôsledku prítoku Ca2+ a vody53. Je zaujímavé, že tento mechanizmus poškodenia buniek je reverzibilný, ak je poškodenie dočasné a bunky začnú produkovať ATP počas určitého časového obdobia, ale ak poškodenie pretrváva alebo sa zhoršuje, bunky umierajú.54 Naše pozorovania ukazujú, že nematódy ošetrené 5-jódindolom nie sú schopné obnoviť normálnu biosyntézu po vystavení stresovým podmienkam.
Metylačný fenotyp indukovaný 5-jódindolom u B. xylophilus môže byť spôsobený prítomnosťou jódu a jeho molekulárnou distribúciou, pretože 7-jódindol mal menší inhibičný účinok na B. xylophilus ako 5-jódindol (tabuľka 1 a doplnkový obrázok S6). Tieto výsledky sú čiastočne v súlade so štúdiami Maltese a kol. (2014), ktorí uviedli, že translokácia pyridylovej dusíkatej skupiny v indole z para- do meta- polohy zrušila vakuolizáciu, inhibíciu rastu a cytotoxicitu v bunkách U251, čo naznačuje, že interakcia molekuly so špecifickým aktívnym miestom v proteíne je kritická27,44,45. Interakcie medzi indolom alebo halogénovanými indolmi a receptormi GluCL pozorované v tejto štúdii tiež podporujú túto myšlienku, pretože sa zistilo, že 5- a 2-jódindol sa viažu na receptory GluCL silnejšie ako ostatné skúmané indoly (obrázok 6 a doplnkový obrázok S8). Zistilo sa, že jód v druhej alebo piatej polohe indolu sa viaže na leucín 218 receptora GluCL prostredníctvom vodíkových väzieb v hlavnom reťazci, zatiaľ čo iné halogénované indoly a samotný indol tvoria slabé vodíkové väzby v bočnom reťazci so serínom 260 (obrázok 6). Preto predpokladáme, že lokalizácia halogénu hrá dôležitú úlohu pri indukcii vakuolárnej degenerácie, zatiaľ čo pevná väzba 5-jódindolu udržiava iónový kanál otvorený, čím umožňuje rýchly prítok tekutiny a prasknutie vakuoly. Podrobný mechanizmus účinku 5-jódindolu však ešte len treba určiť.
Pred praktickým použitím 5-jódindolu je potrebné analyzovať jeho toxický účinok na rastliny. Naše experimenty s klíčením semien ukázali, že 5-jódindol nemal pri skúmaných koncentráciách žiadny negatívny vplyv na klíčenie semien ani na následné vývojové procesy (obrázok 7). Táto štúdia teda poskytuje základ pre použitie 5-jódindolu v ekologickom prostredí na kontrolu škodlivosti borovicových háďatiek.
Predchádzajúce správy preukázali, že terapia na báze indolu predstavuje potenciálny prístup k riešeniu problému rezistencie na antibiotiká a progresie rakoviny55. Okrem toho majú indoly antibakteriálne, protirakovinové, antioxidačné, protizápalové, antidiabetické, antivírusové, antiproliferatívne a antituberkulózne účinky a môžu slúžiť ako sľubný základ pre vývoj liekov56,57. Táto štúdia po prvýkrát naznačuje potenciálne využitie jódu ako antiparazitického a antihelmintického činidla.
Avermektín bol objavený pred tromi desaťročiami a v roku 2015 získal Nobelovu cenu a jeho používanie ako antihelmintika stále aktívne pokračuje. Vzhľadom na rýchly vývoj rezistencie voči avermektínom u háďatiek a hmyzích škodcov je však potrebná alternatívna, nízkonákladová a ekologická stratégia na kontrolu infekcie borovicovým háďatkom. Táto štúdia tiež uvádza mechanizmus, ktorým 5-jódindol zabíja háďatká borovicové, a to, že 5-jódindol má nízku toxicitu pre rastlinné bunky, čo otvára dobré vyhliadky na jeho budúce komerčné využitie.
Všetky experimenty boli schválené Etickou komisiou Univerzity Yeungnam v Gyeongsane v Kórei a metódy boli vykonané v súlade s pokynmi Etickej komisie Univerzity Yeungnam.
Experimenty s inkubáciou vajíčok sa uskutočnili podľa zavedených postupov43. Na posúdenie miery liahnutia (HR) sa 1 deň staré dospelé háďatká (približne 100 samíc a 100 samcov) preniesli do Petriho misiek obsahujúcich hubu a nechali sa rásť 24 hodín. Vajíčka sa potom izolovali a ošetrili sa 5-jódindolom (0,05 mM a 0,1 mM) alebo avermektínom (10 μg/ml) ako suspenzia v sterilnej destilovanej vode. Tieto suspenzie (500 μl; približne 100 vajíčok) sa preniesli do jamiek 24-jamkovej platne na tkanivové kultúry a inkubovali sa pri teplote 22 °C. Po 24 hodinách inkubácie sa vykonalo meranie L2, ale bunky sa považovali za mŕtve, ak sa bunky pri stimulácii jemným platinovým drôtom nepohli. Tento experiment sa uskutočnil v dvoch fázach, každá so šiestimi opakovaniami. Údaje z oboch experimentov boli kombinované a prezentované. Percento HR sa vypočíta takto:
Mortalita lariev bola hodnotená pomocou predtým vyvinutých postupov. Vajíčka háďatiek boli zozbierané a embryá boli synchronizované liahnutím v sterilnej destilovanej vode za účelom generovania lariev v štádiu L2. Synchronizované larvy (približne 500 háďatiek) boli ošetrené 5-jódindolom (0,05 mM a 0,1 mM) alebo avermektínom (10 μg/ml) a chované na Petriho miskách s B. cinerea. Po 48 hodinách inkubácie pri teplote 22 °C boli háďatká zozbierané v sterilnej destilovanej vode a vyšetrené na prítomnosť štádií L2, L3 a L4. Prítomnosť štádií L3 a L4 naznačovala transformáciu larvy, zatiaľ čo prítomnosť štádia L2 nenaznačovala žiadnu transformáciu. Snímky boli získané pomocou systému iRiS™ Digital Cell Imaging System. Tento experiment sa uskutočnil v dvoch fázach, každá so šiestimi opakovaniami. Údaje z oboch experimentov boli kombinované a prezentované.
Toxicita 5-jódindolu a avermektínu pre semená bola hodnotená pomocou testov klíčenia na agarových platniach Murashige a Skoog.62 Semená B. oleracea a R. raphanistrum boli najskôr namočené v sterilnej destilovanej vode na jeden deň, premyté 1 ml 100 % etanolu, sterilizované 1 ml 50 % komerčného bielidla (3 % chlórnan sodný) počas 15 minút a päťkrát premyté 1 ml sterilnej vody. Sterilizované semená boli potom nanesené na agarové platne na klíčenie obsahujúce 0,86 g/l (0,2X) média Murashige a Skoog a 0,7 % bakteriologického agaru s alebo bez 5-jódindolu alebo avermektínu. Platne boli potom inkubované pri teplote 22 °C a snímky boli zhotovené po 3 dňoch inkubácie. Tento experiment sa uskutočnil v dvoch fázach, z ktorých každá mala šesť opakovaní.
Čas uverejnenia: 26. februára 2025