Háďatko borovicové je karanténny migračný endoparazit, o ktorom je známe, že spôsobuje vážne ekonomické straty v ekosystémoch borovicových lesov. Táto štúdia hodnotí nematocídnu aktivitu halogénovaných indolov proti háďatku borovicovým a ich mechanizmus účinku. Nematocídne aktivity 5-jódindolu a avermektínu (pozitívna kontrola) proti háďatku borovicovému boli podobné a vysoké pri nízkych koncentráciách (10 μg/ml). 5-jódindol znížil plodnosť, reprodukčnú aktivitu, embryonálnu a larválnu mortalitu a lokomotorické správanie. Molekulárne interakcie ligandov s receptormi chloridového kanála s glutamátovou bránou špecifickými pre bezstavovcov podporujú názor, že 5-jódindol, podobne ako avermektín, sa pevne viaže na aktívne miesto receptora. 5-Jódindol tiež indukoval rôzne fenotypové deformácie u nematód, vrátane abnormálneho kolapsu/zmršťovania orgánov a zvýšenej vakuolizácie. Tieto výsledky naznačujú, že vakuoly môžu hrať úlohu pri smrti sprostredkovanej metyláciou nematód. Dôležité je, že 5-jódindol bol netoxický pre oba druhy rastlín (kapusta a reďkovka). Táto štúdia teda ukazuje, že aplikácia jódindolu v podmienkach prostredia môže kontrolovať poškodenie vädnutím borovice.
Háďatko borovicové (Bursaphelenchus xylophilus) patrí medzi háďatká borovicové (PWN), sťahovavé endoparazitické háďatká, o ktorých je známe, že spôsobujú vážne ekologické škody na ekosystémoch borovicových lesov1. Choroba vädnutia borovice (PWD) spôsobená háďatkom borovicovým sa stáva vážnym problémom na viacerých kontinentoch vrátane Ázie a Európy av Severnej Amerike háďatko ničí introdukované druhy borovice1,2. Úbytok borovíc je veľkým ekonomickým problémom a vyhliadky na jeho globálne rozšírenie sú znepokojujúce3. Hástka najčastejšie napáda tieto druhy borovíc: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii a Pinus radiata4. Háďatko borovicové je závažné ochorenie, ktoré môže zabiť borovice v priebehu týždňov alebo mesiacov od infekcie. Okrem toho prepuknutia háďatka borovicového sú bežné v rôznych ekosystémoch, takže sa vytvorili pretrvávajúce infekčné reťazce1.
Bursaphelenchus xylophilus je karanténny rastlinný parazitický háďatko patriace do nadčeľade Aphelenchoidea a kladu 102.5. Háďatka sa živia hubami a rozmnožujú sa v drevených tkanivách borovíc, pričom sa vyvíjajú do štyroch rôznych larválnych štádií: L1, L2, L3, L4 a dospelý jedinec1,6. V podmienkach nedostatku potravy prechádza háďatko borovicové do špecializovaného larválneho štádia – dauer, ktoré parazituje na svojom prenášačovi – lykožrútovi (Monochamus alternatus) a prenáša sa na zdravé borovice. U zdravých hostiteľov háďatká rýchlo migrujú cez rastlinné tkanivá a živia sa parenchymatóznymi bunkami, čo vedie k množstvu reakcií z precitlivenosti, vädnutiu borovice a smrti do jedného roka po infekcii1,7,8.
Biologická kontrola háďatka borovicového bola dlho výzvou, pričom karanténne opatrenia siahajú až do 20. storočia. Súčasné stratégie na kontrolu háďatka borovicového zahŕňajú predovšetkým chemické ošetrenie vrátane fumigácie dreva a implantácie nematocídov do kmeňov stromov. Najčastejšie používané nematocídy sú avermektín a avermektín benzoát, ktoré patria do rodiny avermektínov. Tieto drahé chemikálie sú vysoko účinné proti mnohým druhom háďatiek a považujú sa za bezpečné pre životné prostredie9. Očakáva sa však, že opakované používanie týchto nematocídov vytvorí selekčný tlak, ktorý takmer určite povedie k vzniku rezistentných háďatiek borovicových, ako sa preukázalo u niekoľkých hmyzích škodcov, ako sú Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella a háďatká Trichostrongylus colubriformis a Ostertagia circumcincta, u ktorých sa postupne vyvinula rezistencia voči avermectins1,10 Preto je potrebné pravidelne študovať vzory rezistencie a neustále skrínovať nematocídy, aby sa našli alternatívne, nákladovo efektívne a ekologické opatrenia na kontrolu PVD. V posledných desaťročiach viacerí autori navrhli použitie rastlinných extraktov, esenciálnych olejov a prchavých látok ako prostriedkov na kontrolu háďatiek13,14,15,16.
Nedávno sme preukázali nematocídnu aktivitu indolu, medzibunkovej a medzikráľovej signálnej molekuly, v Caenorhabditis elegans 17 . Indol je rozšírený intracelulárny signál v mikrobiálnej ekológii, ktorý riadi početné funkcie, ktoré ovplyvňujú mikrobiálnu fyziológiu, tvorbu spór, stabilitu plazmidov, liekovú rezistenciu, tvorbu biofilmu a virulenciu18,19. Aktivita indolu a jeho derivátov proti iným patogénnym nematódam sa neskúmala. V tejto štúdii sme skúmali nematocídnu aktivitu 34 indolov proti háďatku borovicovým a objasnili sme mechanizmus účinku najsilnejšieho 5-jódindolu pomocou mikroskopie, časozbernej fotografie a experimentov s molekulovým dokovaním a hodnotili sme jeho toxické účinky na rastliny pomocou testu klíčenia semien.
V minulosti sa uvádzalo, že vysoké koncentrácie (> 1,0 mM) indolu majú nematocídny účinok na nematódy17. Po ošetrení B. xylophilus (zmiešané životné štádiá) indolom alebo 33 rôznymi indolovými derivátmi pri 1 mM bola úmrtnosť B. xylophilus meraná spočítaním živých a mŕtvych háďatiek v kontrolnej a liečenej skupine. Päť indolov vykazovalo významnú nematocídnu aktivitu; prežívanie neliečenej kontrolnej skupiny bolo 95 ± 7 % po 24 hodinách. Z 34 testovaných indolov 5-jódindol a 4-fluórindol v koncentrácii 1 mM spôsobili 100 % mortalitu, zatiaľ čo 5,6-difluórindigo, metylindol-7-karboxylát a 7-jódindol spôsobili približne 50 % mortalitu (tabuľka 1).
Účinok 5-jódindolu na tvorbu vakuol a metabolizmus háďatka borovicového. (A) Účinok avermektínu a 5-jódindolu na dospelých samčích háďatiek, (B) vajíčka háďatka v štádiu L1 a (C) metabolizmus B. xylophilus, (i) vakuoly neboli pozorované po 0 h, liečba viedla k (ii) vakuolám, (iii) akumulácii viacerých vakuol, (iv) opuchu vakuol, vakuol a fúzii (vi) tvorba obrovských vakuol. Červené šípky označujú opuch vakuol, modré šípky označujú fúziu vakuol a čierne šípky označujú obrovské vakuoly. Mierka = 50 μm.
Okrem toho táto štúdia opísala aj sekvenčný proces metánom indukovanej smrti u háďatiek borovicových (obrázok 4C). Metanogénna smrť je neapoptotický typ bunkovej smrti spojený s akumuláciou prominentných cytoplazmatických vakuol27. Zdá sa, že morfologické defekty pozorované u háďatka borovicového úzko súvisia s mechanizmom smrti vyvolanej metánom. Mikroskopické vyšetrenie v rôznych časoch ukázalo, že po 20 hodinách expozície 5-jódindolu (0,1 mM) sa vytvorili obrovské vakuoly. Mikroskopické vakuoly sa pozorovali po 8 hodinách liečby a ich počet sa zvýšil po 12 hodinách. Po 14 hodinách bolo pozorovaných niekoľko veľkých vakuol. Niekoľko fúzovaných vakuol bolo jasne viditeľných po 12 až 16 hodinách liečby, čo naznačuje, že fúzia vakuol je základom mechanizmu metanogénnej smrti. Po 20 hodinách sa v červovi našlo niekoľko obrovských vakuol. Tieto pozorovania predstavujú prvú správu o metuóze u C. elegans.
U červov ošetrených 5-jódindolom bola tiež pozorovaná agregácia a prasknutie vakuol (obr. 5), čo dokazuje ohyb červa a uvoľnenie vakuoly do prostredia. Narušenie vakuoly bolo tiež pozorované v membráne vaječnej škrupiny, ktorá je normálne zachovaná neporušená L2 počas liahnutia (doplnkový obrázok S2). Tieto pozorovania podporujú zapojenie akumulácie tekutín a zlyhania osmoregulácie, ako aj reverzibilného poškodenia buniek (RCI) v procese tvorby a hnisania vakuol (obr. 5).
S hypotézou o úlohe jódu v pozorovanej tvorbe vakuol sme skúmali nematocídnu aktivitu jodidu sodného (NaI) a jodidu draselného (KI). Pri koncentráciách (0,1, 0,5 alebo 1 mM) však neovplyvnili ani prežitie háďatka, ani tvorbu vakuol (doplnkový obrázok S5), hoci 1 mM KI mal mierny nematocídny účinok. Na druhej strane 7-jódindol (1 alebo 2 mM), podobne ako 5-jódindol, vyvolal viacnásobné vakuoly a štrukturálne deformácie (doplnkový obrázok S6). Dva jódindoly vykazovali podobné fenotypové charakteristiky u háďatka borovicového, zatiaľ čo NaI a KI nie. Je zaujímavé, že indol neindukoval tvorbu vakuol v B. xylophilus v testovaných koncentráciách (údaje nie sú uvedené). Výsledky teda potvrdili, že komplex indol-jód je zodpovedný za vakuolizáciu a metabolizmus B. xylophilus.
Spomedzi indolov testovaných na nematocídnu aktivitu mal 5-jódindol najvyšší index sklzu -5,89 kcal/mol, po ktorom nasledoval 7-jódindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluórindol (-4,33) a indol (-4,03) (obrázok 6). Silná vodíková väzba hlavného reťazca 5-jódindolu na leucín 218 stabilizuje jeho väzbu, zatiaľ čo všetky ostatné indolové deriváty sa viažu na serín 260 prostredníctvom vodíkových väzieb postranných reťazcov. Spomedzi iných modelovaných jódindolov má 2-jódindol väzbovú hodnotu -5,248 kcal/mol, čo je spôsobené jeho hlavnou vodíkovou väzbou s leucínom 218. Ďalšie známe väzby zahŕňajú 3-jódindol (-4,3 kcal/mol), 4-jódindol (-4,0 kcal/mol)Sucal ppm fluoroindole Obrázok S8). Väčšina halogénovaných indolov a samotný indol, s výnimkou 5-jódindolu a 2-jódindolu, tvorí väzbu so serínom 260. Skutočnosť, že vodíková väzba s leucínom 218 svedčí o účinnej väzbe receptor-ligand, ako sa pozorovalo pre ivermektín (doplnkový obrázok S7), potvrdzuje, že podobne ako iindolecio-5- tesne k aktívnemu miestu GluCL receptora prostredníctvom leucínu 218 (obr. 6 a doplnkový obrázok S8). Navrhujeme, že táto väzba je potrebná na udržanie otvorenej štruktúry pórov komplexu GluCL a že 5-jódindol, 2-jódindol, avermektín a ivermektín tesnou väzbou na aktívne miesto receptora GluCL tak udržiava iónový kanál otvorený a umožňuje príjem tekutín.
Molekulárne dokovanie indolu a halogénovaného indolu ku GluCL. Väzbové orientácie ligandov (A) indolu, (B) 4-fluórindolu, (C) 7-jódindolu a (D) 5-jódindolu na aktívne miesto GluCL. Proteín je znázornený pásikom a vodíkové väzby hlavného reťazca sú znázornené žltými bodkovanými čiarami. (A'), (B'), (C') a (D') znázorňujú interakcie zodpovedajúcich ligandov s okolitými aminokyselinovými zvyškami a vodíkové väzby bočného reťazca sú označené ružovými bodkovanými šípkami.
Boli uskutočnené experimenty na vyhodnotenie toxického účinku 5-jódindolu na klíčenie semien kapusty a reďkovky. 5-Jódindol (0,05 alebo 0,1 mM) alebo avermektín (10 μg/ml) mali malý alebo žiadny vplyv na počiatočné klíčenie a vzídenie rastlín (obrázok 7). Okrem toho sa nezistil žiadny významný rozdiel medzi rýchlosťou klíčenia neošetrených kontrol a semien ošetrených 5-jódindolom alebo avermektínom. Účinok na predĺženie koreňového koreňa a počet vytvorených bočných koreňov bol nevýznamný, hoci 1 mM (10-násobok jeho aktívnej koncentrácie) 5-jódindolu mierne spomalil vývoj bočných koreňov. Tieto výsledky naznačujú, že 5-jódindol je netoxický pre rastlinné bunky a neinterferuje s procesmi vývoja rastlín v študovaných koncentráciách.
Účinok 5-jódindolu na klíčenie semien. Klíčenie, klíčenie a bočné zakorenenie semien B. oleracea a R. raphanistrum na agarovom médiu Murashige a Skoog s alebo bez avermektínu alebo 5-jódindolu. Klíčenie bolo zaznamenané po 3 dňoch inkubácie pri 22 °C.
Táto štúdia uvádza niekoľko prípadov zabíjania háďatiek indolmi. Dôležité je, že toto je prvá správa o jódindole indukujúcom metyláciu (proces spôsobený akumuláciou malých vakuol, ktoré sa postupne spájajú do obrovských vakuol, čo nakoniec vedie k prasknutiu membrány a smrti) v borovicových ihličkách, pričom jódindol vykazuje významné nematocídne vlastnosti podobné vlastnostiam komerčného nematocídu avermektínu.
V minulosti sa uvádzalo, že indoly vykonávajú viaceré signalizačné funkcie v prokaryotoch a eukaryotoch, vrátane inhibície/tvorby biofilmu, prežitia baktérií a patogenity19, 32, 33, 34. Potenciálne terapeutické účinky halogénovaných indolov, indolových alkaloidov a semisyntetických indolových derivátov nedávno prilákali rozsiahly výskumný záujem35,36,37. Napríklad sa ukázalo, že halogénované indoly zabíjajú perzistentné bunky Escherichia coli a Staphylococcus aureus37. Okrem toho je vedecký záujem študovať účinnosť halogénovaných indolov proti iným druhom, rodom a kráľovstvám a táto štúdia je krokom k dosiahnutiu tohto cieľa.
Tu navrhujeme mechanizmus pre 5-jódindolom indukovanú letalitu u C. elegans založený na reverzibilnom poškodení buniek (RCI) a metylácii (obrázky 4C a 5). Edematózne zmeny, ako je opuch a degenerácia vakuol, sú indikátormi RCI a metylácie, ktoré sa prejavujú ako obrovské vakuoly v cytoplazme48,49. RCI interferuje s produkciou energie tým, že znižuje produkciu ATP, spôsobuje zlyhanie pumpy ATPázy alebo narušuje bunkové membrány a spôsobuje rýchly prílev Na+, Ca2+ a vody50,51,52. Intracytoplazmatické vakuoly vznikajú v živočíšnych bunkách ako výsledok akumulácie tekutiny v cytoplazme v dôsledku prílevu Ca2+ a vody53. Je zaujímavé, že tento mechanizmus poškodenia buniek je reverzibilný, ak je poškodenie dočasné a bunky začnú po určitú dobu produkovať ATP, ale ak poškodenie pretrváva alebo sa zhoršuje, bunky odumierajú.54 Naše pozorovania ukazujú, že háďatká ošetrené 5-jódindolom nie sú schopné obnoviť normálnu biosyntézu po vystavení stresovým podmienkam.
Metylačný fenotyp indukovaný 5-jódindolom v B. xylophilus môže byť spôsobený prítomnosťou jódu a jeho molekulárnou distribúciou, pretože 7-jódindol mal menší inhibičný účinok na B. xylophilus ako 5-jódindol (tabuľka 1 a doplnkový obrázok S6). Tieto výsledky sú čiastočne v súlade so štúdiami Maltese et al. (2014), ktorí uviedli, že translokácia pyridylovej dusíkovej skupiny v indole z para- do meta-polohy zrušila vakuolizáciu, inhibíciu rastu a cytotoxicitu v bunkách U251, čo naznačuje, že interakcia molekuly so špecifickým aktívnym miestom v proteíne je kritická27,44,45. Interakcie medzi indolovými alebo halogénovanými indolmi a receptormi GluCL pozorované v tejto štúdii tiež podporujú túto predstavu, pretože sa zistilo, že 5- a 2-jódindol sa viažu na receptory GluCL silnejšie ako ostatné skúmané indoly (obrázok 6 a doplnkový obrázok S8). Zistilo sa, že jód v druhej alebo piatej polohe indolu sa viaže na leucín 218 receptora GluCL prostredníctvom vodíkových väzieb hlavného reťazca, zatiaľ čo iné halogénované indoly a samotný indol tvoria slabé vodíkové väzby v bočnom reťazci so serínom 260 (obrázok 6). Preto špekulujeme, že lokalizácia halogénu hrá dôležitú úlohu pri indukcii vakuolárnej degenerácie, zatiaľ čo tesná väzba 5-jódindolu udržuje iónový kanál otvorený, čím umožňuje rýchly prítok tekutiny a prasknutie vakuoly. Zostáva však určiť podrobný mechanizmus účinku 5-jódindolu.
Pred praktickou aplikáciou 5-jódindolu by sa mal analyzovať jeho toxický účinok na rastliny. Naše experimenty s klíčením semien ukázali, že 5-jódindol nemal žiadny negatívny vplyv na klíčenie semien alebo následné procesy vývoja pri študovaných koncentráciách (obrázok 7). Táto štúdia teda poskytuje základ pre použitie 5-jódindolu v ekologickom prostredí na kontrolu škodlivosti háďatka borovicového na borovice.
Predchádzajúce správy ukázali, že terapia založená na indole predstavuje potenciálny prístup k riešeniu problému rezistencie na antibiotiká a progresie rakoviny55. Okrem toho majú indoly antibakteriálne, protirakovinové, antioxidačné, protizápalové, antidiabetické, antivírusové, antiproliferatívne a antituberkulózne účinky a môžu slúžiť ako sľubný základ pre vývoj liečiv56,57. Táto štúdia po prvýkrát naznačuje potenciálne použitie jódu ako antiparazitárneho a anthelmintického činidla.
Avermektín bol objavený pred tromi desaťročiami a v roku 2015 získal Nobelovu cenu a jeho používanie ako antihelmintika stále aktívne prebieha. Avšak kvôli rýchlemu rozvoju rezistencie voči avermektínom u háďatiek a hmyzích škodcov je potrebná alternatívna, nízkonákladová a ekologická stratégia na kontrolu infekcie háďatkom borovice. Táto štúdia tiež uvádza mechanizmus, ktorým 5-jódindol zabíja háďatká borovicové a že 5-jódindol má nízku toxicitu pre rastlinné bunky, čo otvára dobré vyhliadky na jeho budúce komerčné využitie.
Všetky experimenty boli schválené etickou komisiou Yeungnamskej univerzity, Gyeongsan, Kórea a metódy boli vykonávané v súlade so smernicami etickej komisie Yeungnamskej univerzity.
Experimenty s inkubáciou vajíčok sa uskutočnili s použitím zavedených postupov43. Na posúdenie miery liahnutia (HR) sa dospelé háďatká vo veku 1 deň (približne 100 samíc a 100 samcov) preniesli do Petriho misiek obsahujúcich hubu a nechali sa rásť 24 hodín. Vajcia sa potom izolovali a ošetrili 5-jódindolom (0,05 mM a 0,1 mM) alebo avermektínom (10 ug/ml) ako suspenziou v sterilnej destilovanej vode. Tieto suspenzie (500 ul; približne 100 vajíčok) sa preniesli do jamiek 24-jamkovej doštičky pre tkanivové kultúry a inkubovali sa pri 22 °C. Počty L2 sa uskutočnili po 24 hodinách inkubácie, ale považovali sa za mŕtve, ak sa bunky pri stimulácii jemným platinovým drôtom nepohybovali. Tento experiment sa uskutočnil v dvoch fázach, každá so šiestimi opakovaniami. Údaje z oboch experimentov boli skombinované a prezentované. Percento HR sa vypočíta takto:
Mortalita lariev bola hodnotená pomocou skôr vyvinutých postupov. Odobrali sa vajíčka háďatiek a embryá sa synchronizovali vyliahnutím v sterilnej destilovanej vode, aby sa vytvorili larvy v štádiu L2. Synchronizované larvy (približne 500 háďatiek) boli ošetrené 5-jódindolom (0,05 mM a 0,1 mM) alebo avermektínom (10 ug/ml) a chované na Petriho platniach B. cinerea. Po 48 hodinách inkubácie pri 22 °C sa háďatká zhromaždili v sterilnej destilovanej vode a skúmali sa na prítomnosť štádií L2, L3 a L4. Prítomnosť štádií L3 a L4 indikovala larválnu transformáciu, zatiaľ čo prítomnosť štádia L2 nenaznačovala žiadnu transformáciu. Snímky boli získané pomocou systému digitálneho zobrazovania buniek iRiS™. Tento experiment sa uskutočnil v dvoch fázach, každá so šiestimi opakovaniami. Údaje z oboch experimentov boli skombinované a prezentované.
Toxicita 5-jódindolu a avermektínu na semená sa hodnotila pomocou testov klíčenia na agarových platniach Murashige a Skoog.62 Semená B. oleracea a R. raphanistrum sa najprv namočili do sterilnej destilovanej vody na jeden deň, premyli sa 1 ml 100 % etanolu, sterilizovali sa 1 ml 50% etanolu a 50% chlórnanu sodného premyli. krát s 1 ml sterilnej vody. Sterilizované semená sa potom natlačili na klíčiace agarové platne obsahujúce 0,86 g/l (0,2X) médium Murashige a Skoog a 0,7 % bakteriologický agar s alebo bez 5-jódindolu alebo avermektínu. Doštičky sa potom inkubovali pri 22 °C a snímky sa urobili po 3 dňoch inkubácie. Tento experiment sa uskutočnil v dvoch fázach, z ktorých každá mala šesť opakovaní.
Čas odoslania: 26. februára 2025