Sezónne rozloženie zrážok v provincii Kuej-čou je nerovnomerné, s väčším množstvom zrážok na jar a v lete, ale sadenice repky olejnej sú náchylné na stres zo sucha na jeseň a v zime, čo vážne ovplyvňuje výnos. Horčica je špeciálna olejnatá plodina pestovaná hlavne v provincii Kuej-čou. Má silnú toleranciu voči suchu a možno ju pestovať v horských oblastiach. Je bohatým zdrojom génov odolných voči suchu. Objav génov odolných voči suchu má zásadný význam pre zlepšenie odrôd horčice a inovácie v zdrojoch zárodočnej plazmy. Rodina GRF zohráva kľúčovú úlohu v raste a vývoji rastlín a v reakcii na stres zo sucha. V súčasnosti sa gény GRF nachádzajú v Arabidopsis 2, ryži (Oryza sativa) 12, repke olejnej 13, bavlne (Gossypium hirsutum) 14, pšenici (Triticum aestivum) 15, perlovom prose (Setaria italica) 16 a Brassica 17, ale neexistujú žiadne správy o génoch GRF zistených v horčici. V tejto štúdii boli gény horčice z rodiny GRF identifikované na úrovni celého genómu a boli analyzované ich fyzikálne a chemické vlastnosti, evolučné vzťahy, homológia, konzervované motívy, génová štruktúra, génové duplikácie, cis-elementy a štádium sadenice (štvorlistové štádium). Expresné vzorce v stresových podmienkach sucha boli komplexne analyzované s cieľom poskytnúť vedecký základ pre ďalšie štúdie potenciálnej funkcie génov BjGRF v reakcii na sucho a poskytnúť kandidátske gény pre šľachtenie horčice odolnej voči suchu.
V genóme Brassica juncea bolo pomocou dvoch vyhľadávaní HMMER identifikovaných tridsaťštyri génov BjGRF, pričom všetky obsahujú domény QLQ a WRC. Sekvencie CDS identifikovaných génov BjGRF sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1. BjGRF01–BjGRF34 sú pomenované na základe ich umiestnenia na chromozóme. Fyzikálno-chemické vlastnosti tejto rodiny naznačujú, že dĺžka aminokyselín je vysoko variabilná, v rozmedzí od 261 aminokyselín (BjGRF19) do 905 aminokyselín (BjGRF28). Izoelektrický bod BjGRF sa pohybuje od 6,19 (BjGRF02) do 9,35 (BjGRF03) s priemerom 8,33 a 88,24 % BjGRF tvorí bázický proteín. Predpokladaný rozsah molekulových hmotností BjGRF je od 29,82 kDa (BjGRF19) do 102,90 kDa (BjGRF28); Index nestability proteínov BjGRF sa pohybuje od 51,13 (BjGRF08) do 78,24 (BjGRF19), všetky sú väčšie ako 40, čo naznačuje, že index mastných kyselín sa pohybuje od 43,65 (BjGRF01) do 78,78 (BjGRF22), priemerná hydrofilnosť (GRAVY) sa pohybuje od -1,07 (BjGRF31) do -0,45 (BjGRF22), všetky hydrofilné proteíny BjGRF majú negatívne hodnoty GRAVY, čo môže byť spôsobené nedostatkom hydrofóbnosti spôsobeným zvyškami. Predikcia subcelulárnej lokalizácie ukázala, že 31 proteínov kódovaných BjGRF by mohlo byť lokalizovaných v jadre, BjGRF04 by mohol byť lokalizovaný v peroxizómoch, BjGRF25 by mohol byť lokalizovaný v cytoplazme a BjGRF28 by mohol byť lokalizovaný v chloroplastoch (Tabuľka 1), čo naznačuje, že BjGRF môžu byť lokalizované v jadre a hrať dôležitú regulačnú úlohu ako transkripčný faktor.
Fylogenetická analýza čeľadí GRF u rôznych druhov môže pomôcť pri štúdiu génových funkcií. Preto boli stiahnuté kompletné aminokyselinové sekvencie 35 GRF repky olejnej, 16 GRF repy, 12 GRF ryže, 10 GRF prosa a 9 GRF Arabidopsis a na základe 34 identifikovaných génov BjGRF bol zostavený fylogenetický strom (obr. 1). Tri podčeľade obsahujú rôzny počet členov; 116 GRF TF je rozdelených do troch rôznych podčeľadí (skupiny A~C), ktoré obsahujú 59 (50,86 %), 34 (29,31 %) a 23 (19,83) % GRF. Spomedzi nich je 34 členov čeľade BjGRF roztrúsených v 3 podčeľadiach: 13 členov v skupine A (38,24 %), 12 členov v skupine B (35,29 %) a 9 členov v skupine C (26,47 %). V procese polyploidizácie horčice je počet génov BjGRF v rôznych podčeľadiach odlišný a mohlo dôjsť k amplifikácii a strate génov. Stojí za zmienku, že v skupine C nie je žiadne rozdelenie GRF ryže a prosa, zatiaľ čo v skupine B sú 2 GRF ryže a 1 GRF prosa a väčšina GRF ryže a prosa je zoskupená v jednej vetve, čo naznačuje, že BjGRF sú úzko príbuzné s dvojklíčnolistovými rastlinami. Spomedzi nich najpodrobnejšie štúdie funkcie GRF u Arabidopsis thaliana poskytujú základ pre funkčné štúdie BjGRF.
Fylogenetický strom horčice vrátane Brassica napus, Brassica napus, ryže, prosa a členov čeľade Arabidopsis thaliana GRF.
Analýza repetitívnych génov v rodine GRF horčice. Sivá čiara v pozadí predstavuje synchronizovaný blok v genóme horčice, červená čiara predstavuje pár segmentovaných opakovaní génu BjGRF;
Expresia génu BjGRF pri strese zo sucha v štádiu štvrtého listu. Údaje qRT-PCR sú uvedené v doplnkovej tabuľke S5. Významné rozdiely v údajoch sú označené malými písmenami.
Vzhľadom na to, že sa globálna klíma neustále mení, štúdium toho, ako sa plodiny vyrovnávajú so stresom zo sucha a zlepšovanie ich mechanizmov tolerancie, sa stalo horúcou témou výskumu18. Po suchu sa zmení morfologická štruktúra, génová expresia a metabolické procesy rastlín, čo môže viesť k zastaveniu fotosyntézy a metabolickým poruchám, čo ovplyvní výnos a kvalitu plodín19,20,21. Keď rastliny cítia signály sucha, produkujú sekundárne posly, ako je Ca2+ a fosfatidylinositol, zvyšujú intracelulárnu koncentráciu vápnikových iónov a aktivujú regulačnú sieť dráhy fosforylácie proteínov22,23. Konečný cieľový proteín sa priamo podieľa na bunkovej obrane alebo reguluje expresiu súvisiacich stresových génov prostredníctvom transkripčných faktorov (TF), čím zvyšuje toleranciu rastlín voči stresu24,25. TF teda zohrávajú kľúčovú úlohu v reakcii na stres zo sucha. Podľa sekvencie a vlastností väzby DNA transkripčných faktorov reagujúcich na stres zo sucha možno TF rozdeliť do rôznych čeľadí, ako napríklad GRF, ERF, MYB, WRKY a ďalšie čeľade26.
Génová rodina GRF je typ rastlinne špecifického TF, ktorý hrá dôležitú úlohu v rôznych aspektoch, ako je rast, vývoj, prenos signálu a obranné reakcie rastlín27. Odkedy bol prvý gén GRF identifikovaný u O. sativa28, bolo u mnohých druhov identifikovaných stále viac a viac génov GRF, ktoré preukázateľne ovplyvňujú rast, vývoj a stresovú reakciu rastlín8, 29, 30, 31, 32. S publikovaním genómovej sekvencie Brassica juncea sa stala možná identifikácia génovej rodiny BjGRF33. V tejto štúdii bolo v celom genóme horčice identifikovaných 34 génov BjGRF a pomenovaných BjGRF01–BjGRF34 na základe ich chromozomálnej polohy. Všetky obsahujú vysoko konzervované domény QLQ a WRC. Analýza fyzikálno-chemických vlastností ukázala, že rozdiely v počte aminokyselín a molekulových hmotnostiach proteínov BjGRF (okrem BjGRF28) neboli významné, čo naznačuje, že členovia rodiny BjGRF môžu mať podobné funkcie. Analýza génovej štruktúry ukázala, že 64,7 % génov BjGRF obsahovalo 4 exóny, čo naznačuje, že štruktúra génu BjGRF je v evolúcii relatívne konzervovaná, ale počet exónov v génoch BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 a BjGRF29 je väčší. Štúdie ukázali, že pridanie alebo delécia exónov alebo intrónov môže viesť k rozdielom v štruktúre a funkcii génov, čím sa vytvárajú nové gény34,35,36. Preto predpokladáme, že intrón BjGRF sa počas evolúcie stratil, čo môže spôsobiť zmeny vo funkcii génu. V súlade s existujúcimi štúdiami sme tiež zistili, že počet intrónov súvisel s génovou expresiou. Keď je počet intrónov v géne veľký, gén môže rýchlo reagovať na rôzne nepriaznivé faktory.
Duplikácia génov je hlavným faktorom genomickej a genetickej evolúcie37. Súvisiace štúdie ukázali, že duplikácia génov nielen zvyšuje počet génov GRF, ale slúži aj ako prostriedok na generovanie nových génov, ktoré pomáhajú rastlinám prispôsobiť sa rôznym nepriaznivým podmienkam prostredia38. V tejto štúdii sa našlo celkovo 48 duplicitných párov génov, pričom všetky boli segmentálne duplikácie, čo naznačuje, že segmentálne duplikácie sú hlavným mechanizmom na zvyšovanie počtu génov v tejto čeľadi. V literatúre sa uvádza, že segmentálna duplikácia môže účinne podporovať amplifikáciu členov génovej rodiny GRF u Arabidopsis a jahody a u žiadneho z druhov sa nezistila žiadna tandemová duplikácia tejto génovej rodiny27,39. Výsledky tejto štúdie sú v súlade s existujúcimi štúdiami o čeľadiach Arabidopsis thaliana a jahody, čo naznačuje, že čeľaď GRF môže zvýšiť počet génov a generovať nové gény prostredníctvom segmentálnej duplikácie v rôznych rastlinách.
V tejto štúdii bolo v horčici identifikovaných celkovo 34 génov BjGRF, ktoré boli rozdelené do 3 podčeľadí. Tieto gény vykazovali podobné konzervované motívy a génové štruktúry. Analýza kolinearity odhalila 48 párov duplikácií segmentov v horčici. Promótorová oblasť BjGRF obsahuje cis-pôsobiace prvky spojené so svetelnou odpoveďou, hormonálnou odpoveďou, odpoveďou na environmentálny stres a rastom a vývojom. Expresia 34 génov BjGRF bola detegovaná v štádiu sadenice horčice (korene, stonky, listy) a expresný vzorec 10 génov BjGRF v podmienkach sucha. Zistilo sa, že expresné vzorce génov BjGRF v strese zo sucha boli podobné a môžu byť podobné. Gény BjGRF03 a BjGRF32 môžu hrať pozitívnu regulačnú úlohu pri strese zo sucha, zatiaľ čo BjGRF06 a BjGRF23 hrajú úlohu pri strese zo sucha ako cieľové gény miR396. Celkovo naša štúdia poskytuje biologický základ pre budúci objav funkcie génu BjGRF v rastlinách čeľade Brassicaceae.
Horčičné semená použité v tomto experimente poskytol Výskumný ústav olejnatých semien v Guizhou, Akadémia poľnohospodárskych vied v Guizhou. Vyberte celé semená a zasaďte ich do pôdy (substrát:pôda = 3:1) a po vytvorení štyroch listov zozbierajte korene, stonky a listy. Rastliny boli ošetrené 20 % PEG 6000 na simuláciu sucha a listy boli zozbierané po 0, 3, 6, 12 a 24 hodinách. Všetky vzorky rastlín boli okamžite zmrazené v tekutom dusíku a potom uskladnené v mrazničke pri teplote -80 °C na ďalší test.
Všetky údaje získané alebo analyzované počas tejto štúdie sú zahrnuté v publikovanom článku a doplnkových informačných súboroch.
Čas uverejnenia: 22. januára 2025