Táto štúdia hodnotila letalitu, subletalitu a toxicitu komerčnýchcypermetrínformulácie pre žubrienky bezoárovej. V akútnom teste sa testovali koncentrácie 100 – 800 μg/l počas 96 hodín. V chronickom teste sa testovali prirodzene sa vyskytujúce koncentrácie cypermetrínu (1, 3, 6 a 20 μg/l) na mortalitu, po ktorých nasledovalo testovanie mikronukleov a jadrových abnormalít červených krviniek počas 7 dní. LC50 komerčnej formulácie cypermetrínu pre žubrienky bola 273,41 μg L−1. V chronickom teste viedla najvyššia koncentrácia (20 μg L−1) k viac ako 50 % mortalite, pretože usmrtila polovicu testovaných žubrienok. Mikronukleový test ukázal významné výsledky pri 6 a 20 μg L−1 a zistilo sa niekoľko jadrových abnormalít, čo naznačuje, že komerčná formulácia cypermetrínu má genotoxický potenciál proti P. gracilis. Cypermetrín predstavuje pre tento druh vysoké riziko, čo naznačuje, že môže spôsobiť viacero problémov a ovplyvniť dynamiku tohto ekosystému v krátkodobom aj dlhodobom horizonte. Preto možno usúdiť, že komerčné formulácie cypermetrínu majú toxické účinky na P. gracilis.
Vzhľadom na neustále rozširovanie poľnohospodárskych aktivít a intenzívne uplatňovaniekontrola škodcovopatrenia, vodné živočíchy sú často vystavené pesticídom1,2. Znečistenie vodných zdrojov v blízkosti poľnohospodárskych polí môže ovplyvniť vývoj a prežitie necieľových organizmov, ako sú obojživelníky.
Obojživelníky nadobúdajú čoraz väčší význam pri hodnotení environmentálnych matríc. Obojživelníky sa považujú za dobrých bioindikátorov environmentálnych znečisťujúcich látok vďaka ich jedinečným vlastnostiam, ako sú komplexné životné cykly, rýchly rast lariev, trofický stav, priepustná koža10,11, závislosť od vody pre reprodukciu12 a nechránené vajíčka11,13,14. Malá vodná žaba (Physalaemus gracilis), bežne známa ako plačúca žaba, sa ukázala ako bioindikátor znečistenia pesticídmi4,5,6,7,15. Tento druh sa vyskytuje v stojatých vodách, chránených oblastiach alebo oblastiach s premenlivým biotopom v Argentíne, Uruguaji, Paraguaji a Brazílii1617 a podľa klasifikácie IUCN je považovaný za stabilný kvôli svojmu širokému rozšíreniu a tolerancii voči rôznym biotopom18.
U obojživelníkov boli po expozícii cypermetrínu hlásené subletálne účinky vrátane behaviorálnych, morfologických a biochemických zmien u žubrienok23,24,25, zmenenej úmrtnosti a času metamorfózy, enzymatických zmien, zníženej úspešnosti liahnutia24,25, hyperaktivity26, inhibície aktivity cholínesterázy27 a zmien v plaveckých výkonoch7,28. Štúdie genotoxických účinkov cypermetrínu u obojživelníkov sú však obmedzené. Preto je dôležité posúdiť citlivosť druhov bezobyčejných tvorov na cypermetrín.
Znečistenie životného prostredia ovplyvňuje normálny rast a vývoj obojživelníkov, ale najzávažnejším nepriaznivým účinkom je genetické poškodenie DNA spôsobené expozíciou pesticídom13. Analýza morfológie krvných buniek je dôležitým bioindikátorom znečistenia a potenciálnej toxicity látky pre voľne žijúce druhy29. Mikronukleárny test je jednou z najčastejšie používaných metód na stanovenie genotoxicity chemikálií v životnom prostredí30. Je to rýchla, účinná a lacná metóda, ktorá je dobrým indikátorom chemického znečistenia organizmov, ako sú obojživelníky31,32, a môže poskytnúť informácie o expozícii genotoxickým znečisťujúcim látkam33.
Cieľom tejto štúdie bolo vyhodnotiť toxický potenciál komerčných formulácií cypermetrínu pre malé vodné žubrienky pomocou mikronukleového testu a posúdenia ekologického rizika.
Kumulatívna úmrtnosť (%) žubrienok P. gracilis vystavených rôznym koncentráciám komerčného cypermetrínu počas akútneho obdobia testu.
Kumulatívna úmrtnosť (%) žubrienok P. gracilis vystavených rôznym koncentráciám komerčného cypermetrínu počas chronického testu.
Pozorovaná vysoká úmrtnosť bola výsledkom genotoxických účinkov u obojživelníkov vystavených rôznym koncentráciám cypermetrínu (6 a 20 μg/l), o čom svedčí prítomnosť mikronukleov (MN) a jadrových abnormalít v erytrocytoch. Vznik MN naznačuje chyby v mitóze a je spojený so slabou väzbou chromozómov na mikrotubuly, defektmi v proteínových komplexoch zodpovedných za vychytávanie a transport chromozómov, chybami v segregácii chromozómov a chybami v oprave poškodenia DNA38,39 a môže súvisieť s oxidačným stresom vyvolaným pesticídmi40,41. Ďalšie abnormality boli pozorované pri všetkých hodnotených koncentráciách. Zvyšujúce sa koncentrácie cypermetrínu zvýšili jadrové abnormality v erytrocytoch o 5 % a 20 % pri najnižšej (1 μg/l) a najvyššej (20 μg/l) dávke. Napríklad zmeny v DNA druhu môžu mať vážne následky na krátkodobé aj dlhodobé prežitie, čo vedie k poklesu populácie, zmenenej reprodukčnej zdatnosti, príbuzenskému kríženiu, strate genetickej diverzity a zmenenej miere migrácie. Všetky tieto faktory môžu ovplyvniť prežitie a udržanie druhu42,43. Tvorba erytroidných abnormalít môže naznačovať blokádu cytokinézy, čo vedie k abnormálnemu deleniu buniek (dvojjadrové erytrocyty)44,45; viaclaločné jadrá sú výčnelky jadrovej membrány s viacerými lalokmi46, zatiaľ čo iné erytroidné abnormality môžu byť spojené s amplifikáciou DNA, ako sú jadrové obličky/bubliny47. Prítomnosť bezjadrových erytrocytov môže naznačovať zhoršený transport kyslíka, najmä v kontaminovanej vode48,49. Apoptóza naznačuje bunkovú smrť50.
Iné štúdie tiež preukázali genotoxické účinky cypermetrínu. Kabaña a kol.51 preukázali prítomnosť mikronukleov a jadrových zmien, ako sú dvojjadrové bunky a apoptotické bunky v bunkách Odontophrynus americanus po expozícii vysokým koncentráciám cypermetrínu (5 000 a 10 000 μg L−1) počas 96 hodín. Apoptóza indukovaná cypermetrínom bola zistená aj u P. biligonigerus52 a Rhinella arenarum53. Tieto výsledky naznačujú, že cypermetrín má genotoxické účinky na celý rad vodných organizmov a že test MN a ENA môže byť indikátorom subletálnych účinkov na obojživelníky a môže byť použiteľný pre pôvodné druhy a voľne žijúce populácie vystavené toxínom12.
Komerčné formulácie cypermetrínu predstavujú vysoké environmentálne riziko (akútne aj chronické), pričom HQ prekračujú úroveň stanovenú Agentúrou na ochranu životného prostredia USA (EPA)54 a môžu nepriaznivo ovplyvniť druh, ak sú prítomné v prostredí. V hodnotení chronického rizika bola NOEC pre úmrtnosť 3 μg L−1, čo potvrdzuje, že koncentrácie zistené vo vode môžu predstavovať riziko pre tento druh55. Letálna NOEC pre larvy R. arenarum vystavené zmesi endosulfánu a cypermetrínu bola 500 μg L−1 po 168 hodinách; táto hodnota sa po 336 hodinách znížila na 0,0005 μg L−1. Autori ukazujú, že čím dlhšia je expozícia, tým nižšie sú koncentrácie, ktoré sú pre druh škodlivé. Je tiež dôležité zdôrazniť, že hodnoty NOEC boli vyššie ako u P. gracilis pri rovnakom čase expozície, čo naznačuje, že druhová reakcia na cypermetrín je druhovo špecifická. Okrem toho, pokiaľ ide o úmrtnosť, hodnota CHQ P. gracilis po expozícii cypermetrínu dosiahla 64,67, čo je vyššia hodnota ako referenčná hodnota stanovená Agentúrou na ochranu životného prostredia USA54, a hodnota CHQ lariev R. arenarum bola tiež vyššia ako táto hodnota (CHQ > 388,00 po 336 hodinách), čo naznačuje, že študované insekticídy predstavujú vysoké riziko pre niekoľko druhov obojživelníkov. Vzhľadom na to, že P. gracilis potrebuje na dokončenie metamorfózy približne 30 dní56, možno usudzovať, že študované koncentrácie cypermetrínu môžu prispievať k poklesu populácie tým, že bránia infikovaným jedincom vstúpiť do dospelého alebo reprodukčného štádia v ranom veku.
Pri vypočítanom hodnotení rizika mikronukleov a iných abnormalít jadra erytrocytov sa hodnoty CHQ pohybovali od 14,92 do 97,00, čo naznačuje, že cypermetrín predstavuje potenciálne genotoxické riziko pre P. gracilis aj v jeho prirodzenom prostredí. Vzhľadom na úmrtnosť bola maximálna koncentrácia xenobiotických zlúčenín tolerovateľná pre P. gracilis 4,24 μg L−1. Avšak aj koncentrácie nízke ako 1 μg/L vykazovali genotoxické účinky. Táto skutočnosť môže viesť k zvýšeniu počtu abnormálnych jedincov57 a ovplyvniť vývoj a reprodukciu druhov v ich biotopoch, čo vedie k poklesu populácií obojživelníkov.
Komerčné formulácie insekticídu cypermetrínu vykazovali vysokú akútnu a chronickú toxicitu pre P. gracilis. Bola pozorovaná vyššia úmrtnosť, pravdepodobne v dôsledku toxických účinkov, o čom svedčí prítomnosť mikronukleov a jadrových abnormalít erytrocytov, najmä zúbkovaných jadier, laločnatých jadier a vezikulárnych jadier. Okrem toho študované druhy vykazovali zvýšené environmentálne riziká, akútne aj chronické. Tieto údaje v kombinácii s predchádzajúcimi štúdiami našej výskumnej skupiny ukázali, že aj rôzne komerčné formulácie cypermetrínu stále spôsobovali zníženú aktivitu acetylcholínesterázy (AChE) a butyrylcholínesterázy (BChE) a oxidačný stres58 a viedli k zmenám v plaveckej aktivite a orálnym malformáciám59 u P. gracilis, čo naznačuje, že komerčné formulácie cypermetrínu majú vysokú letálnu a subletálnu toxicitu pre tento druh. Hartmann a kol.60 zistili, že komerčné formulácie cypermetrínu boli najtoxickejšie pre P. gracilis a ďalší druh toho istého rodu (P. cuvieri) v porovnaní s deviatimi ďalšími pesticídmi. To naznačuje, že legálne schválené koncentrácie cypermetrínu na ochranu životného prostredia môžu viesť k vysokej úmrtnosti a dlhodobému poklesu populácie.
Na posúdenie toxicity pesticídu pre obojživelníky sú potrebné ďalšie štúdie, pretože koncentrácie nachádzajúce sa v životnom prostredí môžu spôsobiť vysokú úmrtnosť a predstavovať potenciálne riziko pre P. gracilis. Výskum druhov obojživelníkov by sa mal podporovať, pretože údaje o týchto organizmoch sú obmedzené, najmä o brazílskych druhoch.
Test chronickej toxicity trval 168 hodín (7 dní) za statických podmienok a subletálne koncentrácie boli: 1, 3, 6 a 20 μg ai L−1. V oboch experimentoch bolo hodnotených 10 žubrienok na liečebnú skupinu so šiestimi opakovaniami, čo predstavuje celkovo 60 žubrienok na koncentráciu. Medzitým, ošetrenie iba vodou slúžilo ako negatívna kontrola. Každé experimentálne usporiadanie pozostávalo zo sterilnej sklenenej misky s objemom 500 ml a hustotou 1 žubrienka na 50 ml roztoku. Banka bola prikrytá polyetylénovou fóliou, aby sa zabránilo odparovaniu, a bola neustále prevzdušňovaná.
Voda bola chemicky analyzovaná na stanovenie koncentrácií pesticídov v čase 0, 96 a 168 hodín. Podľa Sabina a kol.68 a Martinsa a kol.69 boli analýzy vykonané v Laboratóriu pre analýzu pesticídov (LARP) Federálnej univerzity v Santa Maria s použitím plynovej chromatografie spojenej s trojitou kvadrupólovou hmotnostnou spektrometriou (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornia, USA). Kvantitatívne stanovenie pesticídov vo vode je uvedené ako doplnkový materiál (tabuľka SM1).
Pre mikronukleárny test (MNT) a test jadrových abnormalít červených krviniek (RNA) bolo analyzovaných 15 žubrienok z každej liečenej skupiny. Žubrienky boli anestetizované 5 % lidokaínom (50 mg g-170) a vzorky krvi boli odobraté srdcovou punkciou pomocou jednorazových heparinizovaných striekačiek. Krvné nátery boli pripravené na sterilných mikroskopických podložných sklíčkach, vysušené na vzduchu, fixované 100 % metanolom (4 °C) počas 2 minút a potom farbené 10 % roztokom Giemsa počas 15 minút v tme. Na konci procesu boli sklíčka premyté destilovanou vodou, aby sa odstránilo prebytočné farbivo, a vysušené pri izbovej teplote.
Najmenej 1000 červených krviniek z každého žubrienky bolo analyzovaných pomocou 100× mikroskopu s objektívom 71 na stanovenie prítomnosti MN a ENA. Celkovo bolo vyhodnotených 75 796 červených krviniek z žubrienok s ohľadom na koncentrácie cypermetrínu a kontroly. Genotoxicita bola analyzovaná podľa metódy Carrasca a kol. a Fenecha a kol.38,72 určením frekvencie nasledujúcich jadrových lézií: (1) bezjadrové bunky: bunky bez jadier; (2) apoptotické bunky: fragmentácia jadra, programovaná bunková smrť; (3) dvojjadrové bunky: bunky s dvoma jadrami; (4) jadrové púčiky alebo vezikulové bunky: bunky s jadrami s malými výbežkami jadrovej membrány, vezikuly podobnej veľkosti ako mikrojadrá; (5) karyolyzované bunky: bunky iba s obrysom jadra bez vnútorného materiálu; (6) vrubované bunky: bunky s jadrami so zjavnými prasklinami alebo vrubmi v ich tvare, nazývané aj jadrá v tvare obličky; (7) laločnaté bunky: bunky s jadrovými výbežkami väčšími ako vyššie uvedené vezikuly; a (8) mikrobunky: bunky so zhutnenými jadrami a redukovanou cytoplazmou. Zmeny boli porovnané s výsledkami negatívnej kontroly.
Výsledky testov akútnej toxicity (LC50) boli analyzované pomocou softvéru GBasic a metódy TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Údaje z chronických testov boli vopred testované na normalitu chýb (Shapiro-Wilks) a homogenitu rozptylu (Bartlett). Výsledky boli analyzované pomocou jednofaktorovej analýzy rozptylu (ANOVA). Na porovnanie údajov medzi sebou bol použitý Tukeyho test a na porovnanie údajov medzi liečenou skupinou a negatívnou kontrolnou skupinou bol použitý Dunnettov test.
Údaje LOEC a NOEC boli analyzované pomocou Dunnettovho testu. Štatistické testy boli vykonané pomocou softvéru Statistica 8.0 (StatSoft) s hladinou významnosti 95 % (p < 0,05).
Čas uverejnenia: 13. marca 2025