Táto štúdia hodnotila letalitu, subletalitu a toxicitu reklamycypermetrínformulácie pre anuranové pulce. V akútnom teste sa testovali koncentrácie 100–800 μg/l počas 96 hodín. V chronickom teste boli prirodzene sa vyskytujúce koncentrácie cypermetrínu (1, 3, 6 a 20 μg/l) testované na mortalitu, po čom nasledovalo mikronukleárne testovanie a jadrové abnormality červených krviniek počas 7 dní. LC50 komerčnej cypermetrínovej formulácie pre pulce bola 273,41 μg L-1. V chronickom teste najvyššia koncentrácia (20 μg L−1) viedla k úmrtnosti viac ako 50 %, keďže zabila polovicu testovaných pulcov. Mikronukleový test ukázal významné výsledky pri 6 a 20 μg L-1 a bolo zistených niekoľko jadrových abnormalít, čo naznačuje, že komerčná formulácia cypermetrínu má genotoxický potenciál proti P. gracilis. Cypermetrín predstavuje pre tento druh vysoké riziko, čo naznačuje, že môže spôsobiť viaceré problémy a ovplyvniť dynamiku tohto ekosystému v krátkodobom aj dlhodobom horizonte. Preto možno vyvodiť záver, že komerčné formulácie cypermetrínu majú toxické účinky na P. gracilis.
V dôsledku neustáleho rozširovania poľnohospodárskych činností a intenzívneho uplatňovanianičenie škodcovvodné živočíchy sú často vystavené pesticídom1,2. Znečistenie vodných zdrojov v blízkosti poľnohospodárskych polí môže ovplyvniť vývoj a prežitie necieľových organizmov, ako sú obojživelníky.
Obojživelníky sú čoraz dôležitejšie pri hodnotení environmentálnych matríc. Anurány sa považujú za dobré bioindikátory environmentálnych polutantov vďaka svojim jedinečným vlastnostiam, ako sú zložité životné cykly, rýchly rast lariev, trofický stav, priepustná koža10,11, závislosť na vode pri rozmnožovaní12 a nechránené vajíčka11,13,14. Ukázalo sa, že malá vodná žaba (Physalaemus gracilis), bežne známa ako plačka, je bioindikátorom znečistenia pesticídmi4,5,6,7,15. Tento druh sa nachádza v stojatých vodách, chránených oblastiach alebo oblastiach s premenlivým biotopom v Argentíne, Uruguaji, Paraguaji a Brazílii1617 a je považovaný za stabilný podľa klasifikácie IUCN vďaka svojmu širokému rozšíreniu a tolerancii rôznych biotopov18.
Subletálne účinky boli hlásené u obojživelníkov po expozícii cypermetrínu, vrátane behaviorálnych, morfologických a biochemických zmien u pulcov23,24,25, zmenenej úmrtnosti a času metamorfózy, enzymatických zmien, zníženej úspešnosti liahnutia24,25, hyperaktivite26, inhibícii aktivity cholínesterázy77 a zmien v plávaní. Štúdie genotoxických účinkov cypermetrínu u obojživelníkov sú však obmedzené. Preto je dôležité posúdiť citlivosť druhov anuranov na cypermetrín.
Znečistenie životného prostredia ovplyvňuje normálny rast a vývoj obojživelníkov, ale najzávažnejším nepriaznivým účinkom je genetické poškodenie DNA spôsobené vystavením pesticídom13. Morfologická analýza krvných buniek je dôležitým bioindikátorom znečistenia a potenciálnej toxicity látky pre voľne žijúce druhy29. Mikronukleárny test je jednou z najčastejšie používaných metód na stanovenie genotoxicity chemických látok v životnom prostredí30. Ide o rýchlu, efektívnu a nenákladnú metódu, ktorá je dobrým indikátorom chemického znečistenia organizmov, ako sú obojživelníky31,32 a môže poskytnúť informácie o vystavení genotoxickým znečisťujúcim látkam33.
Cieľom tejto štúdie bolo vyhodnotiť toxický potenciál komerčných cypermetrínových formulácií pre malé vodné pulce pomocou mikronukleárneho testu a hodnotenia ekologického rizika.
Kumulatívna úmrtnosť (%) pulcov P. gracilis vystavených rôznym koncentráciám komerčného cypermetrínu počas akútneho obdobia testu.
Kumulatívna úmrtnosť (%) pulcov P. gracilis vystavených rôznym koncentráciám komerčného cypermetrínu počas chronického testu.
Pozorovaná vysoká mortalita bola výsledkom genotoxických účinkov u obojživelníkov vystavených rôznym koncentráciám cypermetrínu (6 a 20 μg/l), čo dokazuje prítomnosť mikrojadier (MN) a jadrových abnormalít v erytrocytoch. Tvorba MN naznačuje chyby v mitóze a je spojená so zlou väzbou chromozómov na mikrotubuly, defektmi v proteínových komplexoch zodpovedných za príjem a transport chromozómov, chybami v segregácii chromozómov a chybami pri oprave poškodenia DNA38,39 a môže súvisieť s oxidačným stresom vyvolaným pesticídmi40,41. Ďalšie abnormality boli pozorované pri všetkých hodnotených koncentráciách. Zvyšujúce sa koncentrácie cypermetrínu zvýšili jadrové abnormality v erytrocytoch o 5 % a 20 % pri najnižších (1 μg/l) a najvyšších (20 μg/l) dávkach. Napríklad zmeny v DNA druhu môžu mať vážne dôsledky na krátkodobé aj dlhodobé prežitie, čo má za následok pokles populácie, zmenenú reprodukčnú zdatnosť, príbuzenskú plemenitbu, stratu genetickej diverzity a zmenenú mieru migrácie. Všetky tieto faktory môžu ovplyvniť prežitie a zachovanie druhov42,43. Tvorba erytroidných abnormalít môže naznačovať blokádu cytokinézy, ktorá vedie k abnormálnemu deleniu buniek (dvojjadrové erytrocyty)44,45; multilaločné jadrá sú výbežky jadrovej membrány s viacerými lalokmi46, zatiaľ čo iné erytroidné abnormality môžu byť spojené s amplifikáciou DNA, ako sú jadrové obličky/bubliny47. Prítomnosť aukleárnych erytrocytov môže naznačovať zhoršený transport kyslíka, najmä v kontaminovanej vode48,49. Apoptóza indikuje bunkovú smrť50.
Ďalšie štúdie tiež preukázali genotoxické účinky cypermetrínu. Kabaña et al.51 preukázali prítomnosť mikrojadier a jadrových zmien, ako sú dvojjadrové bunky a apoptotické bunky v bunkách Odontophrynus americanus po vystavení vysokým koncentráciám cypermetrínu (5000 a 10 000 μg L−1) počas 96 hodín. Cypermetrínom indukovaná apoptóza bola tiež detegovaná v P. biligonigerus52 a Rhinella arenarum53. Tieto výsledky naznačujú, že cypermetrín má genotoxické účinky na celý rad vodných organizmov a že test MN a ENA môže byť indikátorom subletálnych účinkov na obojživelníky a môže byť použiteľný na pôvodné druhy a voľne žijúce populácie vystavené toxickým látkam12.
Komerčné formulácie cypermetrínu predstavujú vysoké riziko pre životné prostredie (akútne aj chronické), pričom HQ prekračuje úroveň Agentúry pre ochranu životného prostredia USA (EPA)54, čo môže nepriaznivo ovplyvniť druh, ak je prítomný v životnom prostredí. V hodnotení chronického rizika bola NOEC pre mortalitu 3 μg L-1, čo potvrdzuje, že koncentrácie zistené vo vode môžu predstavovať riziko pre daný druh55. Smrteľná NOEC pre larvy R. arenarum vystavené zmesi endosulfánu a cypermetrínu bola 500 μg L−1 po 168 hodinách; táto hodnota klesla na 0,0005 μg L−1 po 336 hodinách. Autori ukazujú, že čím dlhšia je expozícia, tým nižšie sú koncentrácie, ktoré sú pre daný druh škodlivé. Je tiež dôležité zdôrazniť, že hodnoty NOEC boli vyššie ako hodnoty P. gracilis v rovnakom čase expozície, čo naznačuje, že druhová odpoveď na cypermetrín je druhovo špecifická. Okrem toho, pokiaľ ide o úmrtnosť, hodnota CHQ P. gracilis po expozícii cypermetrínu dosiahla 64,67, čo je viac ako referenčná hodnota stanovená Agentúrou pre ochranu životného prostredia USA54, a hodnota CHQ lariev R. arenarum bola tiež vyššia ako táto hodnota (CHQ > 388,00 po 336 hodinách), čo naznačuje, že niektoré študované druhy insekticídov predstavujú vysoké riziko Vzhľadom na to, že P. gracilis potrebuje na dokončenie metamorfózy približne 30 dní56, možno dospieť k záveru, že študované koncentrácie cypermetrínu môžu prispieť k poklesu populácie tým, že zabránia infikovaným jedincom vstúpiť do dospelého alebo reprodukčného štádia v ranom veku.
Vo vypočítanom hodnotení rizika mikrojadier a iných jadrových abnormalít erytrocytov sa hodnoty CHQ pohybovali od 14,92 do 97,00, čo naznačuje, že cypermetrín mal potenciálne genotoxické riziko pre P. gracilis dokonca aj vo svojom prirodzenom prostredí. Ak vezmeme do úvahy mortalitu, maximálna koncentrácia xenobiotických zlúčenín tolerovateľná pre P. gracilis bola 4,24 μg L−1. Avšak aj koncentrácie už od 1 μg/l vykazovali genotoxické účinky. Táto skutočnosť môže viesť k zvýšeniu počtu abnormálnych jedincov57 a ovplyvniť vývoj a reprodukciu druhov v ich biotopoch, čo vedie k poklesu populácií obojživelníkov.
Komerčné formulácie insekticídu cypermetrínu vykazovali vysokú akútnu a chronickú toxicitu pre P. gracilis. Pozorovala sa vyššia miera úmrtnosti, pravdepodobne v dôsledku toxických účinkov, o čom svedčí prítomnosť jadrových abnormalít mikrojadier a erytrocytov, najmä zúbkovaných jadier, laločnatých jadier a vezikulárnych jadier. Okrem toho skúmané druhy vykazovali zvýšené environmentálne riziká, akútne aj chronické. Tieto údaje v kombinácii s predchádzajúcimi štúdiami našej výskumnej skupiny ukázali, že dokonca aj rôzne komerčné formulácie cypermetrínu stále spôsobovali znížené aktivity acetylcholínesterázy (AChE) a butyrylcholínesterázy (BChE) a oxidačný stres58 a viedli k zmenám v aktivite plávania a orálnym malformáciám59 u P. gracilis, čo naznačuje, že komerčné formulácie cypermetrínu a subletálneho druhu majú vysokú toxicitu pre tento druh lethalmetrinu. Hartmann a kol. 60 zistili, že komerčné formulácie cypermetrínu boli najtoxickejšie pre P. gracilis a ďalšie druhy rovnakého rodu (P. cuvieri) v porovnaní s deviatimi ďalšími pesticídmi. To naznačuje, že zákonom schválené koncentrácie cypermetrínu na ochranu životného prostredia môžu viesť k vysokej úmrtnosti a dlhodobému poklesu populácie.
Na posúdenie toxicity pesticídu pre obojživelníky sú potrebné ďalšie štúdie, pretože koncentrácie zistené v životnom prostredí môžu spôsobiť vysokú úmrtnosť a predstavovať potenciálne riziko pre P. gracilis. Mal by sa podporovať výskum druhov obojživelníkov, keďže údaje o týchto organizmoch sú vzácne, najmä o brazílskych druhoch.
Test chronickej toxicity trval 168 hodín (7 dní) za statických podmienok a subletálne koncentrácie boli: 1, 3, 6 a 20 μg ai L−1. V oboch experimentoch bolo hodnotených 10 pulcov na liečebnú skupinu so šiestimi opakovaniami, celkovo 60 pulcov na koncentráciu. Medzitým ošetrenie iba vodou slúžilo ako negatívna kontrola. Každé experimentálne usporiadanie pozostávalo zo sterilnej sklenenej misky s objemom 500 ml a hustotou 1 pulec na 50 ml roztoku. Banka bola pokrytá polyetylénovou fóliou, aby sa zabránilo odparovaniu a bola nepretržite prevzdušňovaná.
Voda bola chemicky analyzovaná na stanovenie koncentrácií pesticídov po 0, 96 a 168 hodinách. Podľa Sabina a spol. 68 a Martins a kol. 69, analýzy sa uskutočnili v laboratóriu pre analýzu pesticídov (LARP) Federálnej univerzity v Santa Maria pomocou plynovej chromatografie spojenej s trojitým kvadrupólom hmotnostnej spektrometrie (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornia, USA). Kvantitatívne stanovenie pesticídov vo vode je uvedené ako doplnkový materiál (tabuľka SM1).
Pre mikronukleový test (MNT) a test jadrovej abnormality červených krviniek (RNA) sa analyzovalo 15 pulcov z každej liečenej skupiny. Pulce boli anestetizované 5% lidokaínom (50 mg g-170) a vzorky krvi boli odobraté srdcovou punkciou s použitím jednorazových heparinizovaných striekačiek. Krvné nátery boli pripravené na sterilných mikroskopických sklíčkach, vysušené na vzduchu, fixované 100% metanolom (4 °C) počas 2 minút a potom zafarbené 10% roztokom Giemsa počas 15 minút v tme. Na konci procesu sa sklíčka premyli destilovanou vodou, aby sa odstránila prebytočná škvrna, a vysušili sa pri teplote miestnosti.
Najmenej 1000 červených krviniek z každého pulca sa analyzovalo pomocou 100-násobného mikroskopu s objektívom 71 na stanovenie prítomnosti MN a ENA. Celkovo bolo hodnotených 75 796 červených krviniek z pulcov s ohľadom na koncentrácie cypermetrínu a kontroly. Genotoxicita sa analyzovala podľa metódy Carrasca et al. a Fenech et al.38,72 stanovením frekvencie nasledujúcich jadrových lézií: (1) bezjadrové bunky: bunky bez jadier; (2) apoptotické bunky: jadrová fragmentácia, programovaná bunková smrť; (3) dvojjadrové bunky: bunky s dvoma jadrami; (4) nukleárne pupene alebo bublinkové bunky: bunky s jadrami s malými výbežkami jadrovej membrány, blistre podobné veľkosti ako mikrojadrá; (5) karyolyzované bunky: bunky len s obrysom jadra bez vnútorného materiálu; (6) vrúbkované bunky: bunky s jadrami so zjavnými prasklinami alebo zárezmi v ich tvare, tiež nazývané obličkovité jadrá; (7) laločnaté bunky: bunky s jadrovými výbežkami väčšími ako vyššie uvedené vezikuly; a (8) mikrobunky: bunky s kondenzovanými jadrami a redukovanou cytoplazmou. Zmeny boli porovnané s výsledkami negatívnych kontrol.
Výsledky testu akútnej toxicity (LC50) sa analyzovali pomocou softvéru GBasic a metódy TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Údaje z chronického testu boli vopred testované na normalitu chyby (Shapiro-Wilks) a homogenitu rozptylu (Bartlett). Výsledky boli analyzované pomocou jednosmernej analýzy rozptylu (ANOVA). Tukeyov test sa použil na porovnanie údajov medzi nimi a Dunnettov test sa použil na porovnanie údajov medzi liečenou skupinou a negatívnou kontrolnou skupinou.
Údaje LOEC a NOEC sa analyzovali pomocou Dunnettovho testu. Štatistické testy boli vykonané pomocou softvéru Statistica 8.0 (StatSoft) s hladinou významnosti 95 % (p < 0,05).
Čas odoslania: 13. marca 2025