BielkovinyLA sú konzervovanéregulátorov rastuktoré zohrávajú ústrednú úlohu vo vývoji rastlín v reakcii na vnútorné a vonkajšie signály. Ako regulátory transkripcie sa DELLA viažu na transkripčné faktory (TF) a histón H2A prostredníctvom svojich domén GRAS a sú prijímané, aby pôsobili na promótory. Nedávne štúdie ukázali, že stabilita DELLA je regulovaná posttranslačne dvoma mechanizmami: polyubikvitináciou vyvolanou rastlinným hormónomgiberelín, čo vedie k ich rýchlej degradácii, a konjugácii s malým modifikátorom podobným ubikvitínu (SUMO), čo zvyšuje ich akumuláciu. Okrem toho je aktivita DELLA dynamicky regulovaná dvoma odlišnými glykozylačnými mechanizmami: O-fukozylácia zvyšuje interakciu DELLA-TF, zatiaľ čo modifikácia O-viazaného N-acetylglukózamínu (O-GlcNAc) inhibuje interakciu DELLA-TF. Úloha fosforylácie DELLA je však nejasná, pretože predchádzajúce štúdie ukázali protichodné výsledky, pričom niektoré naznačujú, že fosforylácia podporuje alebo potláča degradáciu DELLA a iné naznačujú, že fosforylácia neovplyvňuje ich stabilitu. Tu identifikujeme fosforylačné miesta v represore GA1-3 (RGA), AtDELLA, purifikovanom z Arabidopsis thaliana hmotnostnou spektrometriou a ukazujeme, že fosforylácia dvoch RGA peptidov v oblastiach PolyS a PolyS/T zvyšuje aktivitu RGA podporou väzby H2A a asociácie RGA s cieľovými promótormi. Je pozoruhodné, že fosforylácia neovplyvnila interakcie RGA-TF alebo stabilitu RGA. Naša štúdia odhaľuje molekulárny mechanizmus, ktorým fosforylácia indukuje aktivitu DELLA.
Naša hmotnostná spektrometrická analýza odhalila, že Pep1 aj Pep2 boli vysoko fosforylované v RGA na pozadí Gal s deficitom GA. Okrem tejto štúdie fosfoproteomické štúdie tiež odhalili fosforyláciu Pep1 v RGA, hoci jej úloha ešte nebola študovaná53, 54, 55. Na rozdiel od toho fosforylácia Pep2 nebola predtým opísaná, pretože tento peptid bolo možné detegovať iba pomocou transgénu RGAGKG. Hoci mutácia m1A, ktorá zrušila fosforyláciu Pep1, iba mierne znížila aktivitu RGA v planta, mala aditívny účinok v kombinácii s m2A pri znižovaní aktivity RGA (doplnkový obrázok 6). Dôležité je, že fosforylácia Pep1 bola významne znížená v mutante sly1 s vylepšeným GA v porovnaní s gal, čo naznačuje, že GA podporuje defosforyláciu RGA a znižuje jej aktivitu. Mechanizmus, ktorým GA potláča fosforyláciu RGA, si vyžaduje ďalšie skúmanie. Jednou z možností je, že sa to dosiahne reguláciou neidentifikovanej proteínkinázy. Hoci štúdie ukázali, že expresia CK1 proteínkinázy EL1 je downregulovaná GA v ryži41, naše výsledky naznačujú, že mutácie vyššieho rádu homológu Arabidopsis EL1 (AEL1-4) neznižujú fosforyláciu RGA. V súlade s našimi výsledkami nedávna fosfoproteomická štúdia využívajúca línie nadmerne exprimujúce Arabidopsis AEL a trojitý mutant ael neidentifikovala žiadne proteíny DELLA ako substráty týchto kináz56. Keď sme pripravili rukopis, bolo oznámené, že GSK3, gén kódujúci kinázu podobnú GSK3/SHAGGY v pšenici (Triticum aestivum), môže fosforylovať DELLA (Rht-B1b)57, hoci fosforylácia Rht-B1b pomocou GSK3 nebola potvrdená v planta. In vitro enzymatické reakcie v prítomnosti GSK3 nasledované analýzou hmotnostnou spektrometriou odhalili tri fosforylačné miesta umiestnené medzi doménami DELLA a GRAS Rht-B1b (doplnkový obrázok 3). Substitúcie serínu za alanín na všetkých troch miestach fosforylácie viedli k zníženiu aktivity Rht-B1b v transgénnej pšenici, čo je v súlade s našimi zisteniami, že substitúcie alanínu v Pep2 RGA znížili aktivitu RGA. In vitro testy degradácie proteínov však ďalej ukázali, že fosforylácia môže tiež stabilizovať Rht-B1b57. To je v kontraste s našimi výsledkami, ktoré ukazujú, že substitúcie alanínu v Pep2 RGA nemenia jeho stabilitu v planta. GSK3 v pšenici je ortológ proteínu 2 necitlivého na brassinosteroidy (BIN2) v Arabidopsis 57. BIN2 je negatívny regulátor signalizácie BR a BR aktivuje svoju signálnu dráhu tým, že spôsobí degradáciu BIN2 58. Ukázali sme, že liečba BR neznižuje stabilitu RGA 59 alebo naznačuje, že hladiny fosforylácie RS2 v Arabidopsis sú na obrázku byť fosforylovaný BIN2.
Všetky kvantitatívne údaje sa štatisticky analyzovali pomocou Excelu a významné rozdiely sa určili pomocou Studentovho t-testu. Na predbežné určenie veľkosti vzorky neboli použité žiadne štatistické metódy. Z analýzy neboli vylúčené žiadne údaje; experiment nebol náhodný; a výskumníci si boli vedomí alokácie počas experimentu a hodnotenia výsledkov. Veľkosti vzoriek sú uvedené v legendách obrázkov a v súboroch s nespracovanými údajmi.
Čas odoslania: 15. apríla 2025