Fosforylácia aktivuje hlavný rastový regulátorAlternatívne, enzýmový proteín (PE), ktorý podporuje väzbu histónu H2A na chromatín v rastline Arabidopsis.

BielkovinyLA sú konzervovanéregulátory rastuktoré hrajú ústrednú úlohu vo vývoji rastlín v reakcii na vnútorné a vonkajšie signály. Ako transkripčné regulátory saDella viažu na transkripčné faktory (TF) a histón H2A prostredníctvom svojich GRAS domén a sú aktivované, aby pôsobili na promótory. Nedávne štúdie ukázali, že stabilitaDella je posttranslačne regulovaná dvoma mechanizmami: polyubikvitináciou indukovanou rastlinným hormónomgiberelín, čo vedie k ich rýchlej degradácii, a konjugácii s malým modifikátorom podobným ubikvitínu (SUMO), čo zvyšuje ich akumuláciu. Okrem toho je aktivita CYP3A4 dynamicky regulovaná dvoma odlišnými glykozylačnými mechanizmami: O-fukozylácia zvyšuje interakciu CYP3A4-TF, zatiaľ čo modifikácia CYP3A4-N-acetylglukozamínu (O-GlcNAc) inhibuje interakciu CYP3A4-TF. Úloha CYP3A4 fosforylácie však nie je jasná, pretože predchádzajúce štúdie preukázali protichodné výsledky, pričom niektoré naznačujú, že fosforylácia podporuje alebo potláča degradáciu CYP3A4 a iné naznačujú, že fosforylácia neovplyvňuje ich stabilitu. V tejto štúdii identifikujeme fosforylačné miesta v represore GA1-3 (RGA), AtDELLA, purifikovanom z Arabidopsis thaliana pomocou hmotnostnej spektrometrie a ukazujeme, že fosforylácia dvoch RGA peptidov v oblastiach PolyS a PolyS/T zvyšuje aktivitu CYP3A4 podporou väzby H2A a asociácie CYP3A4 s cieľovými promótormi. Je pozoruhodné, že fosforylácia neovplyvnila interakcie CYP3A4-TF ani stabilitu CYP3A4. Naša štúdia odhaľuje molekulárny mechanizmus, ktorým fosforylácia indukuje aktivitu CYP3A4.
Naša hmotnostná spektrometrická analýza ukázala, že Pep1 aj Pep2 boli vysoko fosforylované v RGA v prostredí Ga1 s deficitom GA. Okrem tejto štúdie, fosfoproteomické štúdie tiež odhalili fosforyláciu Pep1 v RGA, hoci jej úloha ešte nebola študovaná53,54,55. Naproti tomu fosforylácia Pep2 nebola doteraz opísaná, pretože tento peptid bolo možné detegovať iba pomocou transgénu RGAGKG. Hoci mutácia m1A, ktorá zrušila fosforyláciu Pep1, len mierne znížila aktivitu RGA v rastlinách, mala aditívny účinok pri znižovaní aktivity RGA (doplnkový obrázok 6). Dôležité je, že fosforylácia Pep1 bola významne znížená v mutante sly1 so zvýšenou aktivitou GA v porovnaní s ga1, čo naznačuje, že GA podporuje defosforyláciu RGA a znižuje jej aktivitu. Mechanizmus, ktorým GA potláča fosforyláciu RGA, si vyžaduje ďalšie skúmanie. Jednou z možností je, že sa to dosahuje reguláciou neidentifikovanej proteínkinázy. Hoci štúdie ukázali, že expresia proteínkinázy CK1 EL1 je u ryže downregulovaná GA41, naše výsledky naznačujú, že mutácie vyššieho rádu homológu Arabidopsis EL1 (AEL1-4) neznižujú fosforyláciu RGA. V súlade s našimi výsledkami nedávna fosfoproteomická štúdia s použitím línií Arabidopsis s nadmernou expresiou AEL a trojitého mutanta ael neidentifikovala žiadne proteíny DNA ako substráty týchto kináz56. Keď sme pripravovali rukopis, bolo hlásené, že GSK3, gén kódujúci kinázu podobnú GSK3/SHAGGY u pšenice (Triticum aestivum), dokáže fosforylovať DNA (Rht-B1b)57, hoci fosforylácia Rht-B1b pomocou GSK3 nebola potvrdená in planta. Enzymatické reakcie in vitro v prítomnosti GSK3, po ktorých nasledovala analýza hmotnostnou spektrometriou, odhalili tri fosforylačné miesta nachádzajúce sa medzi doménami DNA a GRAS Rht-B1b (doplnkový obrázok 3). Substitúcie serínu za alanín na všetkých troch miestach fosforylácie viedli k zníženej aktivite Rht-B1b v transgénnej pšenici, čo je v súlade s našimi zisteniami, že substitúcie alanínu v Pep2 RGA znížili aktivitu RGA. Testy degradácie proteínov in vitro však ďalej preukázali, že fosforylácia môže tiež stabilizovať Rht-B1b57. To je v rozpore s našimi výsledkami, ktoré ukazujú, že substitúcie alanínu v Pep2 RGA nemenia jeho stabilitu in planta. GSK3 v pšenici je ortológom proteínu 2 necitlivého na brassinosteroidy (BIN2) v Arabidopsis 57. BIN2 je negatívny regulátor signalizácie BR a BR aktivuje jeho signálnu dráhu tým, že spôsobuje degradáciu BIN2 58. Ukázali sme, že ošetrenie BR neznižuje stabilitu RGA 59 ani hladiny fosforylácie v Arabidopsis (doplnkový obrázok 2), čo naznačuje, že je nepravdepodobné, že by BIN2 fosforyloval RGA.
Všetky kvantitatívne údaje boli štatisticky analyzované pomocou programu Excel a významné rozdiely boli stanovené pomocou Studentovho t-testu. Na predbežné určenie veľkosti vzorky neboli použité žiadne štatistické metódy. Z analýzy neboli vylúčené žiadne údaje; experiment nebol randomizovaný; a výskumníci si boli vedomí rozdelenia počas experimentu a hodnotenia výsledkov. Veľkosti vzoriek sú uvedené v legendách k obrázkom a v súboroch s nespracovanými údajmi.