Rast výhonkov apikálneho meristému (SAM) je rozhodujúci pre architektúru stonky. Rastlinné hormónygiberelíny(GA) zohrávajú kľúčovú úlohu pri koordinácii rastu rastlín, ale ich úloha v SAM zostáva nedostatočne pochopená. Tu sme vyvinuli pomerový biosenzor signalizácie GA inžinierstvom proteínu DELLA na potlačenie jeho základnej regulačnej funkcie v transkripčnej odpovedi GA pri zachovaní jeho degradácie pri rozpoznávaní GA. Preukazujeme, že tento biosenzor založený na degradácii presne zaznamenáva zmeny hladín GA a bunkového snímania počas vývoja. Tento biosenzor sme použili na mapovanie signalizačnej aktivity GA v SAM. Ukazujeme, že signály s vysokým GA sú prítomné prevažne v bunkách umiestnených medzi orgánovými primordiami, ktoré sú prekurzormi internodiálnych buniek. Pomocou prístupov so ziskom a stratou funkcie ďalej demonštrujeme, že GA reguluje orientáciu roviny bunkového delenia, čím vytvára kanonickú bunkovú organizáciu internodov, čím podporuje špecifikáciu internodov v SAM.
Apikálny meristém výhonku (SAM), ktorý sa nachádza na vrchole výhonku, obsahuje výklenok kmeňových buniek, ktorých aktivita generuje laterálne orgány a kmeňové uzly modulárnym a iteračným spôsobom počas celého života rastliny. Každá z týchto opakujúcich sa jednotiek alebo uzlov rastlín zahŕňa internódie a laterálne orgány v uzlinách a axilárne meristémy v pazuchách listov1. Rast a organizácia uzlov rastlín sa počas vývoja mení. U Arabidopsis je internodálny rast počas vegetatívneho štádia potlačený a axilárne meristémy zostávajú v pazuchách listov ružíc nečinné. Počas prechodu do kvetinovej fázy sa SAM stáva meristémom kvetenstva, generujúcim predĺžené internódiá a pazušné puky, konáriky v pazuchách karamelových listov a neskôr bezlisté kvety2. Aj keď sme urobili významný pokrok v pochopení mechanizmov, ktoré riadia iniciáciu listov, kvetov a konárov, o tom, ako vznikajú internódiá, sa vie pomerne málo.
Pochopenie časopriestorovej distribúcie GA pomôže lepšie pochopiť funkcie týchto hormónov v rôznych tkanivách a v rôznych vývojových štádiách. Vizualizácia degradácie fúzie RGA-GFP vyjadrená pôsobením vlastného promótora poskytuje dôležité informácie o regulácii celkových hladín GA v koreňoch15,16. Expresia RGA sa však v tkanivách líši17 a je regulovaná GA18. Rozdielna expresia promótora RGA teda môže viesť k fluorescenčnému vzoru pozorovanému s RGA-GFP, a preto táto metóda nie je kvantitatívna. Nedávno bioaktívny fluoresceín (Fl) značený GA19,20 odhalil akumuláciu GA v koreňovom endokortexe a reguláciu jeho bunkových hladín transportom GA. Nedávno senzor GA FRET nlsGPS1 ukázal, že hladiny GA korelujú s predĺžením buniek v koreňoch, vláknach a tmavo pestovaných hypokotyloch21. Ako sme však videli, koncentrácia GA nie je jediným parametrom riadiacim signalizačnú aktivitu GA, pretože závisí od zložitých procesov snímania. Na základe nášho chápania signálnych dráh DELLA a GA uvádzame vývoj a charakterizáciu pomerového biosenzora založeného na degradácii pre signalizáciu GA. Na vývoj tohto kvantitatívneho biosenzora sme použili mutantný RGA citlivý na GA, ktorý bol fúzovaný s fluorescenčným proteínom a všadeprítomne exprimovaný v tkanivách, ako aj fluorescenčný proteín necitlivý na GA. Ukazujeme, že mutantné proteínové fúzie RGA neinterferujú s endogénnou signalizáciou GA, keď sú všadeprítomne exprimované, a že tento biosenzor môže kvantifikovať signalizačnú aktivitu vyplývajúcu zo vstupu GA aj zo spracovania signálu GA snímacím prístrojom s vysokým časopriestorovým rozlíšením. Tento biosenzor sme použili na mapovanie časopriestorovej distribúcie signalizačnej aktivity GA a kvantifikáciu toho, ako GA reguluje bunkové správanie v epidermis SAM. Ukazujeme, že GA reguluje orientáciu deliacej roviny buniek SAM umiestnených medzi orgánovými primordiami, čím definuje kanonickú bunkovú organizáciu internodia.
Nakoniec sme sa opýtali, či qmRGA môže hlásiť zmeny v endogénnych hladinách GA pomocou rastúcich hypokotylov. Predtým sme ukázali, že dusičnany stimulujú rast zvýšením syntézy GA a následne degradáciou DELLA34. V súlade s tým sme pozorovali, že dĺžka hypokotylu v sadeníc pUBQ10:: qmRGA pestovaných v hojnej dodávke dusičnanov (10 mM NO3-) bola výrazne dlhšia ako u sadeníc pestovaných v podmienkach s nedostatkom dusičnanov (doplnkový obrázok 6a). V súlade s rastovou odpoveďou boli signály GA vyššie v hypokotyloch sadeníc pestovaných v podmienkach 10 mM NO3- ako v sadeníc pestovaných v neprítomnosti dusičnanov (doplnkový obrázok 6b, c). qmRGA teda tiež umožňuje sledovanie zmien v signalizácii GA vyvolaných endogénnymi zmenami koncentrácie GA.
Aby sme pochopili, či signalizačná aktivita GA detegovaná pomocou qmRGA závisí od koncentrácie GA a vnímania GA, ako sa očakávalo na základe návrhu senzora, analyzovali sme expresiu troch receptorov GID1 vo vegetatívnych a reprodukčných tkanivách. V semenákoch reportérová línia GID1-GUS ukázala, že GID1a a c boli vysoko exprimované v kotyledónoch (obr. 3a–c). Okrem toho boli všetky tri receptory exprimované v listoch, primordiách laterálnych koreňov, špičkách koreňov (okrem koreňového uzáveru GID1b) a cievnom systéme (obr. 3a–c). V kvetenstve SAM sme detekovali signály GUS iba pre GID1b a 1c (doplnkový obrázok 7a–c). In situ hybridizácia potvrdila tieto expresné vzory a ďalej preukázala, že GID1c bol jednotne exprimovaný na nízkych hladinách v SAM, zatiaľ čo GID1b vykazoval vyššiu expresiu na periférii SAM (doplnkový obrázok 7d–l). Translačná fúzia pGID1b::2xmTQ2-GID1b tiež odhalila odstupňovaný rozsah expresie GID1b, od nízkej alebo žiadnej expresie v strede SAM po vysokú expresiu na hraniciach orgánov (doplnkový obrázok 7m). Receptory GID1 teda nie sú rovnomerne distribuované v tkanivách av rámci nich. V nasledujúcich experimentoch sme tiež pozorovali, že nadmerná expresia GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) zvýšila citlivosť qmRGA v hypokotyloch na externú aplikáciu GA (obr. 3d, e). Naproti tomu fluorescencia meraná pomocou qdl7mRGA v hypokotyle bola necitlivá na ošetrenie GA3 (obr. 3f, g). Pre oba testy sa sadenice ošetrili vysokými koncentráciami GA (100 μM GA3), aby sa vyhodnotilo rýchle správanie senzora, kde sa zvýšila alebo stratila schopnosť viazať sa na GID1 receptor. Tieto výsledky spoločne potvrdzujú, že biosenzor qmRGA slúži kombinovanej funkcii ako senzor GA a GA a naznačujú, že diferenciálna expresia receptora GID1 môže významne modulovať emisivitu senzora.
K dnešnému dňu zostáva distribúcia signálov GA v SAM nejasná. Preto sme použili rastliny exprimujúce qmRGA a reportér kmeňových buniek pCLV3::mCherry-NLS35 na výpočet kvantitatívnych máp GA signalizačnej aktivity s vysokým rozlíšením so zameraním na vrstvu L1 (epidermis; obr. 4a, b, pozri metódy a doplnkové metódy), keďže L1 hrá kľúčovú úlohu pri kontrole rastu SAM36. Tu expresia pCLV3::mCherry-NLS poskytla pevný geometrický referenčný bod na analýzu časopriestorovej distribúcie signalizačnej aktivity GA37. Aj keď sa GA považuje za nevyhnutný pre vývoj laterálnych orgánov4, pozorovali sme, že signály GA boli nízke v kvetinovom primordiu (P) počnúc štádiom P3 (obr. 4a, b), zatiaľ čo mladé primordiá P1 a P2 mali miernu aktivitu podobnú tej v centrálnej oblasti (obr. 4a, b). Vyššia signalizačná aktivita GA bola detegovaná na hraniciach orgánového primordia, počnúc P1 / P2 (na stranách hranice) a vrcholila na P4, ako aj vo všetkých bunkách periférnej oblasti umiestnenej medzi primordiami (obr. 4a, b a doplnkový obrázok 8a, b). Táto vyššia signalizačná aktivita GA bola pozorovaná nielen v epidermis, ale aj vo vrstvách L2 a horných L3 (doplnkový obrázok 8b). Vzor GA signálov detekovaných v SAM pomocou qmRGA tiež zostal nezmenený v priebehu času (doplnkový obrázok 8c – f, k). Aj keď bol konštrukt qd17mRGA systematicky downregulovaný v SAM rastlín T3 z piatich nezávislých línií, ktoré sme podrobne charakterizovali, dokázali sme analyzovať fluorescenčné vzory získané s konštruktom pRPS5a:: VENUS-2A-TagBFP (doplnkový obrázok 8g–j, l). V tejto kontrolnej línii boli v SAM detegované iba malé zmeny v pomere fluorescencie, ale v centre SAM sme pozorovali jasný a neočakávaný pokles VENUSY spojený s TagBFP. To potvrdzuje, že signálny vzor pozorovaný qmRGA odráža degradáciu mRGA-VENUS závislú od GA, ale tiež ukazuje, že qmRGA môže preceňovať signálnu aktivitu GA v centre meristému. Stručne povedané, naše výsledky odhaľujú signálny vzor GA, ktorý primárne odráža distribúciu primordií. Táto distribúcia interprimordiálnej oblasti (IPR) je spôsobená postupným etablovaním sa vysokej GA signalizačnej aktivity medzi vyvíjajúcim sa primordiom a centrálnou oblasťou, pričom súčasne klesá GA signalizačná aktivita v primordiu (obr. 4c, d).
Distribúcia receptorov GID1b a GID1c (pozri vyššie) naznačuje, že rozdielna expresia receptorov GA pomáha formovať vzorec signalizačnej aktivity GA v SAM. Zaujímalo nás, či môže ísť o diferenciálnu akumuláciu GA. Na preskúmanie tejto možnosti sme použili senzor nlsGPS1 GA FRET21. Zvýšená frekvencia aktivácie bola zistená v SAM nlsGPS1 ošetreného 10 μM GA4 + 7 počas 100 minút (doplnkový obrázok 9a–e), čo naznačuje, že nlsGPS1 reaguje na zmeny koncentrácie GA v SAM, ako to robí v koreňoch21. Priestorové rozloženie frekvencie aktivácie nlsGPS1 odhalilo relatívne nízke hladiny GA vo vonkajších vrstvách SAM, ale ukázalo sa, že boli zvýšené v strede a na hraniciach SAM (obr. 4e a doplnkový obrázok 9a, c). To naznačuje, že GA je tiež distribuovaný v SAM s priestorovým vzorom porovnateľným s tým, ktorý odhalil qmRGA. Ako doplnkový prístup sme tiež ošetrili SAM fluorescenčným GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) alebo samotným Fl ako negatívnou kontrolou. Signál Fl bol distribuovaný v celom SAM, vrátane centrálnej oblasti a primordia, aj keď s nižšou intenzitou (obr. 4j a doplnkový obrázok 10d). Na rozdiel od toho, všetky tri GA-Fl sa akumulovali špecificky v rámci hraníc primordia a v rôznej miere vo zvyšku IPR, pričom GA7-Fl sa hromadil v najväčšej doméne v IPR (obr. 4k a doplnkový obrázok 10a, b). Kvantifikácia intenzity fluorescencie odhalila, že pomer intenzity IPR k intenzite bez IPR bol vyšší v SAM ošetrenom GA-Fl v porovnaní s SAM ošetreným Fl (obr. 41 a doplnkový obrázok 10c). Tieto výsledky spoločne naznačujú, že GA je prítomný vo vyšších koncentráciách v IPR bunkách, ktoré sa nachádzajú najbližšie k hranici orgánu. To naznačuje, že vzor signalizačnej aktivity SAM GA je výsledkom tak rozdielnej expresie GA receptorov, ako aj rozdielnej akumulácie GA v IPR bunkách v blízkosti hraníc orgánov. Naša analýza teda odhalila neočakávaný časopriestorový vzor signalizácie GA s nižšou aktivitou v strede a primordiu SAM a vyššou aktivitou v IPR v periférnej oblasti.
Aby sme pochopili úlohu diferenciálnej signalizačnej aktivity GA v SAM, analyzovali sme koreláciu medzi signalizačnou aktivitou GA, expanziou buniek a bunkovým delením pomocou časozberného zobrazovania SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS v reálnom čase. Vzhľadom na úlohu GA v regulácii rastu sa očakávala pozitívna korelácia s parametrami bunkovej expanzie. Preto sme najprv porovnali mapy signálnej aktivity GA s mapami rýchlosti rastu bunkového povrchu (ako proxy pre silu bunkovej expanzie pre danú bunku a pre dcérske bunky pri delení) a s mapami rastovej anizotropie, ktorá meria smerovosť bunkovej expanzie (používa sa aj tu pre danú bunku a pre dcérske bunky pri delení; Obr. 5a,b, pozri Metódy a doplnkové metódy). Naše mapy rýchlosti rastu povrchu buniek SAM sú v súlade s predchádzajúcimi pozorovaniami38,39, s minimálnymi rýchlosťami rastu na hranici a maximálnymi rýchlosťami rastu vo vyvíjajúcich sa kvetoch (obr. 5a). Analýza hlavnej zložky (PCA) ukázala, že signalizačná aktivita GA negatívne korelovala s intenzitou rastu bunkového povrchu (obrázok 5c). Tiež sme ukázali, že hlavné osi variácie, vrátane vstupu signalizácie GA a intenzity rastu, boli ortogonálne k smeru určenému vysokou expresiou CLV3, čo potvrdzuje vylúčenie buniek z centra SAM v zostávajúcich analýzach. Spearmanova korelačná analýza potvrdila výsledky PCA (obrázok 5d), čo naznačuje, že vyššie signály GA v IPR neviedli k vyššej expanzii buniek. Korelačná analýza však odhalila miernu pozitívnu koreláciu medzi signalizačnou aktivitou GA a rastovou anizotropiou (obrázok 5c, d), čo naznačuje, že vyššia signalizácia GA v IPR ovplyvňuje smer bunkového rastu a možno aj polohu roviny bunkového delenia.
a, b Tepelné mapy stredného povrchového rastu (a) a rastovej anizotropie (b) v SAM spriemerované pre sedem nezávislých rastlín (používané ako proxy pre silu a smer bunkovej expanzie, v tomto poradí). c PCA analýza zahŕňala nasledujúce premenné: GA signál, intenzita povrchového rastu, anizotropia povrchového rastu a expresia CLV3. PCA komponent 1 bol hlavne negatívne korelovaný s intenzitou rastu povrchu a pozitívne koreloval s GA signálom. PCA zložka 2 bola hlavne pozitívne korelovaná s anizotropiou povrchového rastu a negatívne korelovala s expresiou CLV3. Percentá predstavujú variácie vysvetlené každou zložkou. d Spearmanova korelačná analýza medzi signálom GA, intenzitou povrchového rastu a anizotropiou povrchového rastu v tkanivovej škále s výnimkou CZ. Číslo vpravo je Spearmanova rho hodnota medzi dvoma premennými. Hviezdičky označujú prípady, keď je korelácia/negatívna korelácia veľmi významná. e 3D vizualizácia buniek Col-0 SAM L1 konfokálnou mikroskopiou. Nové bunkové steny vytvorené v SAM (ale nie primordium) po 10 hodinách sú zafarbené podľa ich hodnôt uhla. Farebný pruh je zobrazený v pravom dolnom rohu. Vložka zobrazuje zodpovedajúci 3D obraz o 0 h. Experiment sa opakoval dvakrát s podobnými výsledkami. f Rámcové grafy zobrazujú mieru delenia buniek v IPR a non-IPR Col-0 SAM (n = 10 nezávislých rastlín). Stredová čiara ukazuje medián a hranice rámčeka označujú 25. a 75. percentil. Whiskery označujú minimálne a maximálne hodnoty určené pomocou softvéru R. Hodnoty P sa získali pomocou Welchovho dvojstranného t-testu. g, h Schematický diagram znázorňujúci (g), ako merať uhol novej bunkovej steny (purpurová) vzhľadom k radiálnemu smeru od stredu SAM (biela bodkovaná čiara) (uvažujú sa iba hodnoty ostrého uhla, tj 0–90°), a (h) obvodové/laterálne a radiálne smery v rámci meristému. i Frekvenčné histogramy orientácie roviny bunkového delenia cez SAM (tmavomodrá), IPR (stredne modrá) a non-IPR (svetlomodrá). Hodnoty P boli získané obojstranným Kolmogorov-Smirnovovým testom. Experiment sa opakoval dvakrát s podobnými výsledkami. j Frekvenčné histogramy orientácie roviny bunkového delenia IPR okolo P3 (svetlozelená), P4 (stredne zelená) a P5 (tmavozelená). Hodnoty P boli získané obojstranným Kolmogorov-Smirnovovým testom. Experiment sa opakoval dvakrát s podobnými výsledkami.
Preto sme ďalej skúmali koreláciu medzi signalizáciou GA a aktivitou bunkového delenia identifikáciou novovytvorených bunkových stien počas testu (obr. 5e). Tento prístup nám umožnil zmerať frekvenciu a smer bunkového delenia. Prekvapivo sme zistili, že frekvencia bunkových delení v IPR a vo zvyšku SAM (non-IPR, obr. 5f) bola podobná, čo naznačuje, že rozdiely v GA signalizácii medzi IPR a non-IPR bunkami významne neovplyvňujú bunkové delenie. Toto a pozitívna korelácia medzi signalizáciou GA a rastovou anizotropiou nás prinútili zvážiť, či signalizačná aktivita GA môže ovplyvniť orientáciu roviny bunkového delenia. Zmerali sme orientáciu novej bunkovej steny ako ostrý uhol vzhľadom na radiálnu os spájajúcu stred meristému a stred novej bunkovej steny (obr. 5e-i) a pozorovali sme jasnú tendenciu buniek deliť sa v uhloch blízkych 90° vzhľadom na radiálnu os, pričom najvyššie frekvencie boli pozorované pri 70–80° (23,28,2 %) a 8 %. 5e,i), čo zodpovedá deleniu buniek v obvodovom/priečnom smere (obr. 5h). Aby sme preskúmali príspevok GA signalizácie k tomuto správaniu bunkového delenia, analyzovali sme parametre bunkového delenia v IPR a non-IPR oddelene (obr. 5i). Pozorovali sme, že distribúcia uhla delenia v IPR bunkách sa líšila od distribúcie v non-IPR bunkách alebo v bunkách v celom SAM, pričom IPR bunky vykazovali vyšší podiel laterálnych/kruhových delení buniek, tj 70–80° a 80–90° (33,86 % a 30,71 %, zodpovedajúce podiely) (obr. 5i). Naše pozorovania teda odhalili súvislosť medzi vysokou signalizáciou GA a orientáciou roviny bunkového delenia v blízkosti obvodového smeru, podobne ako korelácia medzi signalizačnou aktivitou GA a rastovou anizotropiou (obr. 5c, d). Na ďalšie stanovenie priestorovej konzervácie tejto asociácie sme merali orientáciu deliacej roviny v IPR bunkách obklopujúcich primordium počnúc od P3, pretože najvyššia signalizačná aktivita GA bola detegovaná v tejto oblasti od P4 (obr. 4). Uhly delenia IPR okolo P3 a P4 nevykazovali žiadne štatisticky významné rozdiely, hoci v IPR okolo P4 bola pozorovaná zvýšená frekvencia laterálnych delení buniek (obr. 5j). V IPR bunkách okolo P5 sa však rozdiel v orientácii roviny bunkového delenia stal štatisticky významným, s prudkým zvýšením frekvencie priečnych delení buniek (obr. 5j). Tieto výsledky spoločne naznačujú, že signalizácia GA môže kontrolovať orientáciu bunkových delení v SAM, čo je v súlade s predchádzajúcimi správami40, 41 že vysoká signalizácia GA môže indukovať laterálnu orientáciu bunkových delení v IPR.
Predpokladá sa, že bunky v IPR nebudú začlenené do primordií, ale skôr do internódií2,42,43. Priečna orientácia bunkových delení v IPR môže viesť k typickej organizácii paralelných pozdĺžnych radov epidermálnych buniek v internódiách. Naše pozorovania opísané vyššie naznačujú, že signalizácia GA pravdepodobne hrá úlohu v tomto procese reguláciou smeru bunkového delenia.
Strata funkcie niekoľkých génov DELLA má za následok konštitutívnu odpoveď GA a na testovanie tejto hypotézy sa môžu použiť della mutanty44. Najprv sme analyzovali expresné vzory piatich génov DELLA v SAM. Transkripčná fúzia línie GUS45 odhalila, že GAI, RGA, RGL1 a RGL2 (v oveľa menšej miere) boli vyjadrené v SAM (doplnkový obrázok 11a – d). In situ hybridizácia ďalej preukázala, že GAI mRNA sa špecificky akumuluje v primordiách a vo vyvíjajúcich sa kvetoch (doplnkový obrázok 11e). RGL1 a RGL3 mRNA boli detegované v celom baldachýne SAM a v starších kvetoch, zatiaľ čo mRNA RGL2 bola hojnejšia v pohraničnej oblasti (doplnkový obrázok 11f–h). Konfokálne zobrazovanie pRGL3::RGL3-GFP SAM potvrdilo expresiu pozorovanú in situ hybridizáciou a ukázalo, že proteín RGL3 sa akumuluje v centrálnej časti SAM (doplnkový obrázok 11i). Pomocou línie pRGA:: GFP-RGA sme tiež zistili, že proteín RGA sa akumuluje v SAM, ale jeho množstvo sa znižuje na hranici od P4 (doplnkový obrázok 11j). Pozoruhodné je, že expresné vzory RGL3 a RGA sú konzistentné s vyššou signalizačnou aktivitou GA v IPR, ako sa zistilo pomocou qmRGA (obr. 4). Okrem toho tieto údaje naznačujú, že všetky DELLA sú vyjadrené v SAM a že ich vyjadrenie spoločne pokrýva celý SAM.
Ďalej sme analyzovali parametre bunkového delenia v štandardnom SAM (Ler, kontrola) a gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della päťnásobných (globálnych) mutantoch (obr. 6a, b). Zaujímavé je, že sme pozorovali štatisticky významný posun v distribúcii frekvencií uhlu delenia buniek u della globálneho mutanta SAM v porovnaní s divokým typom (obr. 6c). Táto zmena v globálnom mutante della bola spôsobená zvýšením frekvencie uhlov 80–90° (34,71 % vs. 24,55 %) a v menšej miere uhlov 70–80 ° (23,78 % vs. 20,18 %), teda zodpovedajúcich priečnemu deleniu buniek (obr. 6c). Frekvencia nepriečnych delení (0–60°) bola tiež nižšia v globálnom mutante della (obr. 6c). Frekvencia priečnych delení buniek bola významne zvýšená v SAM globálneho mutanta della (obr. 6b). Frekvencia priečnych delení buniek v IPR bola tiež vyššia u della globálneho mutanta v porovnaní s divokým typom (obr. 6d). Mimo oblasti IPR mal divoký typ rovnomernejšiu distribúciu uhlov bunkového delenia, zatiaľ čo della globálny mutant preferoval tangenciálne delenie ako IPR (obr. 6e). Tiež sme kvantifikovali orientáciu bunkových delení v SAM päťnásobných mutantov ga2 oxidázy (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 a ga2ox6-2), GA-neaktívneho mutantného pozadia, v ktorom sa akumuluje GA. V súlade so zvýšením hladín GA bola SAM päťnásobného mutantného kvetenstva ga2ox väčšia ako u Col-0 (doplnkový obrázok 12a, b) a v porovnaní s Col-0 päťnásobný ga2ox SAM vykazoval zreteľne odlišnú distribúciu uhlov delenia buniek, pričom frekvencia uhla sa zvýšila z 50° na 90°, opäť uprednostňovalo tangenciálne delenie. 12a–c). Ukazujeme teda, že konštitutívna aktivácia signalizácie GA a akumulácia GA indukujú laterálne bunkové delenie v IPR a zvyšku SAM.
a, b 3D vizualizácia vrstvy L1 PI-farbeného Ler (a) a globálneho della mutanta (b) SAM pomocou konfokálnej mikroskopie. Nové bunkové steny vytvorené v SAM (ale nie v primordiu) počas 10 hodín sú zobrazené a zafarbené podľa ich hodnôt uhla. Vložka zobrazuje SAM o 0 h. Farebný pruh sa zobrazí v pravom dolnom rohu. Šípka v (b) ukazuje na príklad zarovnaných bunkových súborov v globálnom della mutante. Experiment sa opakoval dvakrát s podobnými výsledkami. ce porovnanie frekvenčnej distribúcie orientácií roviny bunkového delenia v celej SAM (d), IPR (e) a non-IPR (f) medzi Ler a globálnym della. Hodnoty P boli získané pomocou dvojstranného Kolmogorov-Smirnovovho testu. f, g 3D vizualizácia konfokálnych obrazov PI-zafarbených SAM transgénnych rastlín Col-0 (i) a pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panely (a, b) ukazujú nové bunkové steny (ale nie primordia) vytvorené v SAM do 10 hodín. Experiment sa opakoval dvakrát s podobnými výsledkami. h–j Porovnanie frekvenčnej distribúcie orientácií roviny bunkového delenia nachádzajúcich sa v celej SAM (h), IPR (i) a non-IPR (j) medzi rastlinami Col-0 a pCUC2::gai-1-VENUS. Hodnoty P boli získané pomocou dvojstranného Kolmogorov-Smirnovovho testu.
Ďalej sme testovali účinok inhibície signalizácie GA špecificky v IPR. Na tento účel sme použili promótor kotyledónového pohára 2 (CUC2) na riadenie expresie dominantného negatívneho proteínu gai-1 fúzovaného s VENUŠOU (v línii pCUC2::gai-1-VENUS). V SAM divokého typu riadi promótor CUC2 expresiu väčšiny IPR v SAM, vrátane hraničných buniek, od P4 ďalej a podobná špecifická expresia bola pozorovaná v rastlinách pCUC2::gai-1-VENUS (pozri nižšie). Distribúcia uhlov bunkového delenia cez SAM alebo IPR rastlín pCUC2::gai-1-VENUS sa významne nelíšila od distribúcie divokého typu, aj keď sme neočakávane zistili, že bunky bez IPR v týchto rastlinách sa delili s vyššou frekvenciou 80–90 ° (obr. 6f–j).
Bolo navrhnuté, že smer bunkového delenia závisí od geometrie SAM, najmä od ťahového napätia generovaného zakrivením tkaniva46. Preto sme sa pýtali, či sa tvar SAM zmenil v globálnom mutante della a rastlinách pCUC2::gai-1-VENUS. Ako bolo uvedené vyššie12, veľkosť della globálneho mutantu SAM bola väčšia ako veľkosť divokého typu (doplnkový obrázok 13a, b, d). In situ hybridizácia CLV3 a STM RNA potvrdila expanziu meristému v della mutantoch a ďalej ukázala laterálnu expanziu výklenku kmeňových buniek (doplnkový obrázok 13e, f, h, i). Zakrivenie SAM však bolo podobné v oboch genotypoch (doplnkový obrázok 13k, m, n, p). Pozorovali sme podobný nárast veľkosti v štvornásobnom mutante gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della bez zmeny zakrivenia v porovnaní s divokým typom (doplnkový obrázok 13c, d, g, j, l, o, p). Frekvencia orientácie bunkového delenia bola ovplyvnená aj v della štvornásobnom mutante, ale v menšej miere ako v della monolitickom mutante (doplnkový obrázok 12d – f). Tento dávkový účinok spolu s nedostatkom účinku na zakrivenie naznačuje, že zvyšková aktivita RGL3 v štvornásobnom mutante Della obmedzuje zmeny v orientácii bunkového delenia spôsobené stratou aktivity DELLA a že zmeny v laterálnom delení buniek sa vyskytujú skôr ako odpoveď na zmeny v signalizačnej aktivite GA ako na zmeny v geometrii SAM. Ako je opísané vyššie, promótor CUC2 riadi expresiu IPR v SAM počnúc P4 (doplnkový obrázok 14a, b) a naopak, pCUC2:: gai-1-VENUS SAM mal zmenšenú veľkosť, ale vyššie zakrivenie (doplnkový obrázok 14c – h). Táto zmena v morfológii pCUC2::gai-1-VENUS SAM môže viesť k odlišnej distribúcii mechanických napätí v porovnaní s divokým typom, v ktorom vysoké obvodové napätia začínajú v kratšej vzdialenosti od centra SAM47. Alternatívne môžu zmeny v morfológii pCUC2::gai-1-VENUS SAM vyplývať zo zmien regionálnych mechanických vlastností vyvolaných expresiou transgénu48. V oboch prípadoch by to mohlo čiastočne kompenzovať účinky zmien v signalizácii GA zvýšením pravdepodobnosti, že sa bunky rozdelia v obvodovej / priečnej orientácii, čo vysvetľuje naše pozorovania.
Celkovo naše údaje potvrdzujú, že vyššia signalizácia GA hrá aktívnu úlohu v laterálnej orientácii roviny bunkového delenia v IPR. Ukazujú tiež, že zakrivenie meristému tiež ovplyvňuje orientáciu roviny bunkového delenia v IPR.
Priečna orientácia deliacej roviny v IPR v dôsledku vysokej signalizačnej aktivity GA naznačuje, že GA vopred organizuje radiálny bunkový súbor v epidermis v rámci SAM, aby definoval bunkovú organizáciu, ktorá sa neskôr nachádza v epidermálnom internode. V skutočnosti boli takéto bunkové súbory často viditeľné na obrázkoch SAM globálnych mutantov della (obr. 6b). Aby sme teda ďalej preskúmali vývojovú funkciu priestorového vzoru signalizácie GA v SAM, použili sme časozberné zobrazovanie na analýzu priestorovej organizácie buniek v IPR v divokých typoch (Ler a Col-0), della globálnych mutantoch a transgénnych rastlinách pCUC2::gai-1-VENUS.
Zistili sme, že qmRGA ukázal, že signalizačná aktivita GA v IPR sa zvýšila z P1/P2 a vyvrcholila na P4 a tento vzor zostal v priebehu času konštantný (obr. 4a–f a doplnkový obr. 8c–f, k). Na analýzu priestorovej organizácie buniek v IPR so zvyšujúcim sa signálom GA sme označili bunky Ler IPR nad a po stranách P4 podľa ich vývojového osudu analyzovaného 34 hodín po prvom pozorovaní, tj viac ako dva plastidové časy, čo nám umožňuje sledovať bunky IPR počas vývoja primordia od P1 / P2 po P4. Použili sme tri rôzne farby: žltú pre tie bunky, ktoré boli integrované do primordia blízko P4, zelenú pre tie, ktoré boli v IPR a fialovú pre tie, ktoré sa zúčastnili oboch procesov (obr. 7a–c). V t0 (0 h) boli pred P4 viditeľné 1–2 vrstvy buniek IPR (obr. 7a). Ako sa dalo očakávať, keď sa tieto bunky delili, robili to hlavne cez rovinu priečneho delenia (obr. 7a–c). Podobné výsledky boli získané s použitím Col-0 SAM (so zameraním na P3, ktorého okraj sa prehýba podobne ako P4 v Ler), hoci v tomto genotype záhyb vytvorený na kvetinovom okraji rýchlejšie skryl bunky IPR (obr. 7g–i). Vzorec delenia buniek IPR teda vopred organizuje bunky do radiálnych radov, ako v internódiách. Organizácia radiálnych radov a lokalizácia IPR buniek medzi po sebe nasledujúcimi orgánmi naznačuje, že tieto bunky sú internodálnymi progenitormi.
Tu sme vyvinuli pomerový signálny biosenzor GA, qmRGA, ktorý umožňuje kvantitatívne mapovanie signalizačnej aktivity GA vyplývajúcej z kombinovaných koncentrácií receptorov GA a GA pri minimalizácii interferencie s endogénnymi signálnymi dráhami, čím poskytuje informácie o funkcii GA na bunkovej úrovni. Na tento účel sme skonštruovali modifikovaný proteín DELLA, mRGA, ktorý stratil schopnosť viazať interakčných partnerov DELLA, ale zostáva citlivý na proteolýzu indukovanú GA. qmRGA reaguje na exogénne aj endogénne zmeny hladín GA a jeho dynamické snímacie vlastnosti umožňujú hodnotenie časopriestorových zmien signalizačnej aktivity GA počas vývoja. qmRGA je tiež veľmi flexibilný nástroj, pretože sa dá prispôsobiť rôznym tkanivám zmenou promótora použitého na jeho expresiu (ak je to potrebné) a vzhľadom na zachovanú povahu signálnej dráhy GA a motívu PFYRE naprieč krytosemennými rastlinami je pravdepodobné, že bude prenosný na iné druhy22. V súlade s tým sa tiež ukázalo, že ekvivalentná mutácia v ryžovom proteíne SLR1 DELLA (HYY497AAA) potláča aktivitu represora rastu SLR1, pričom len mierne znižuje jeho GA-sprostredkovanú degradáciu, podobne ako mRGA23. Nedávne štúdie v Arabidopsis ukázali, že jediná aminokyselinová mutácia v doméne PFYRE (S474L) zmenila transkripčnú aktivitu RGA bez ovplyvnenia jej schopnosti interagovať s partnermi transkripčného faktora50. Aj keď je táto mutácia veľmi blízka 3 aminokyselinovým substitúciám prítomným v mRGA, naše štúdie ukazujú, že tieto dve mutácie menia odlišné charakteristiky DELLA. Aj keď sa väčšina partnerov transkripčného faktora viaže na domény LHR1 a SAW DELLA26, 51, niektoré konzervované aminokyseliny v doméne PFYRE môžu pomôcť stabilizovať tieto interakcie.
Vývoj internodov je kľúčovou črtou v architektúre rastlín a zlepšovaní výnosov. qmRGA odhalil vyššiu signalizačnú aktivitu GA v progenitorových bunkách internodu IPR. Kombináciou kvantitatívneho zobrazovania a genetiky sme ukázali, že signalizačné vzory GA prekrývajú kruhové / priečne roviny bunkového delenia v epidermis SAM, čím sa formuje organizácia bunkového delenia potrebná na vývoj internodov. Počas vývoja bolo identifikovaných niekoľko regulátorov orientácie roviny bunkového delenia52,53. Naša práca poskytuje jasný príklad toho, ako signalizačná aktivita GA reguluje tento bunkový parameter. DELLA môže interagovať s predzloženými proteínovými komplexmi41, takže GA signalizácia môže regulovať orientáciu v rovine bunkového delenia priamym ovplyvňovaním orientácie kortikálnych mikrotubulov40, 41, 54, 55. Neočakávane sme ukázali, že v SAM korelátom vyššej signalizačnej aktivity GA nebolo predlžovanie alebo delenie buniek, ale iba anizotropia rastu, čo je v súlade s priamym účinkom GA na smer bunkového delenia v IPR. Nemôžeme však vylúčiť, že tento účinok by mohol byť aj nepriamy, napríklad sprostredkovaný GA-indukovaným zmäkčovaním bunkovej steny56. Zmeny vlastností bunkovej steny vyvolávajú mechanické napätie57,58, ktoré môže ovplyvniť aj orientáciu roviny bunkového delenia ovplyvnením orientácie kortikálnych mikrotubulov39,46,59. Kombinované účinky mechanického namáhania vyvolaného GA a priamej regulácie orientácie mikrotubulov pomocou GA sa môžu podieľať na vytváraní špecifického vzoru orientácie bunkového delenia v IPR na definovanie internódií a na testovanie tejto myšlienky sú potrebné ďalšie štúdie. Podobne predchádzajúce štúdie zdôraznili dôležitosť proteínov TCP14 a 15 interagujúcich s DELLA pri kontrole tvorby internodov60, 61 a tieto faktory môžu sprostredkovať pôsobenie GA spolu s BREVIPEDICELLUS (BP) a PENNYWISE (PNY), ktoré regulujú vývoj internodov a ukázalo sa, že ovplyvňujú signalizáciu GA2,62. Vzhľadom na to, že DELLA interagujú so signálnymi dráhami brassinosteroidu, etylénu, kyseliny jasmónovej a kyseliny abscisovej (ABA)63,64 a že tieto hormóny môžu ovplyvňovať orientáciu mikrotubulov65, účinky GA na orientáciu bunkového delenia môžu byť sprostredkované aj inými hormónmi.
Skoré cytologické štúdie ukázali, že vnútorné aj vonkajšie oblasti Arabidopsis SAM sú potrebné na vývoj internodia2,42. Skutočnosť, že GA aktívne reguluje bunkové delenie vo vnútorných tkanivách12, podporuje dvojitú funkciu GA pri regulácii veľkosti meristému a internodia v SAM. Vzor smerového delenia buniek je tiež prísne regulovaný vo vnútornom tkanive SAM a táto regulácia je nevyhnutná pre rast kmeňa52. Bude zaujímavé preskúmať, či GA zohráva úlohu aj pri orientácii roviny bunkového delenia vo vnútornej organizácii SAM, čím sa synchronizuje špecifikácia a vývoj internodov v rámci SAM.
Rastliny boli pestované in vitro v pôde alebo 1x Murashige-Skoog (MS) médiu (Duchefa) doplnenom 1% sacharózou a 1% agarom (Sigma) za štandardných podmienok (16 h svetlo, 22 °C), s výnimkou experimentov s hypokotylom a rastom koreňov, pri ktorých sa sadenice pestovali na vertikálnych platniach pri konštantnom svetle a 22 °C. Pre experimenty s dusičnanmi boli rastliny pestované na modifikovanom MS médiu (bioWORLD rastlinné médium) doplnenom adekvátnym dusičnanom (0 alebo 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinátom, 1 % sacharózou a 1 % A-agarom (Sigma) za podmienok dlhého dňa.
GID1a cDNA vložená do pDONR221 bola rekombinovaná s pDONR P4-P1R-pUBQ10 a pDONR P2R-P3-mCherry do pB7m34GW za vzniku pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA vložená do pDONR221 bola rekombinovaná do pB7RWG266 za vzniku p35S:IDD2-RFP. Na vytvorenie pGID1b::2xmTQ2-GID1b sa najskôr amplifikoval 3,9 kb fragment upstream od kódujúcej oblasti GID1b a 4,7 kb fragment obsahujúci GID1b cDNA (1,3 kb) a terminátor (3,4 kb) pomocou primérov v doplnkovej tabuľke 3 a Fish1RTheR-P4rific) pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), v tomto poradí, a nakoniec sa rekombinoval s pDONR221 2xmTQ268 do cieľového vektora pGreen 012567 pomocou klonovania Gateway. Aby sa vytvoril pCUC2::LSSmOrange, sekvencia promótora CUC2 (3229 bp proti smeru ATG) nasledovaná kódujúcou sekvenciou veľkého Stokesovho posunutého mOrange (LSSmOrange)69 s N7 nukleárnym lokalizačným signálom a NOS transkripčným terminátorom boli zostavené do pGreen kanamycínového reštrikčného vektora 3fragogénneho génu. Rastlinný binárny vektor bol zavedený do Agrobacterium tumefaciens kmeňa GV3101 a zavedený do listov Nicotiana benthamiana metódou infiltrácie Agrobacterium a do Arabidopsis thaliana Col-0 metódou kvetinového máčania, v danom poradí. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry a pCLV3::mCherry-NLS qmRGA boli izolované z F3 a F1 potomstva príslušných krížení.
Hybridizácia RNA in situ sa uskutočnila na približne 1 cm dlhých špičkách výhonkov72, ktoré sa zozbierali a okamžite fixovali v roztoku FAA (3,7 % formaldehyd, 5 % kyselina octová, 50 % etanol) vopred ochladenom na 4 °C. Po 2 x 15 minútach vákuového ošetrenia sa fixačné činidlo vymenilo a vzorky sa inkubovali cez noc. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 a RGL3 cDNA a antisense sondy k ich 3'-UTR boli syntetizované pomocou primérov uvedených v doplnkovej tabuľke 3, ako je opísané v Rosier et al.73. Sondy značené digoxigenínom boli imunodetekované pomocou protilátok proti digoxigenínu (3000-násobné riedenie; Roche, katalógové číslo: 11 093 274 910) a rezy boli zafarbené 5-bróm-4-chlór-3-indolylfosfátom (BCIP, 250-násobné riedenie tetrazolium (02-násobné riedenie)/nitromodrá.0T
Čas odoslania: Feb-10-2025