Rast apikálneho meristému (SAM) výhonku je rozhodujúci pre architektúru stonky. Rastlinné hormónygiberelíny(GA) zohrávajú kľúčovú úlohu v koordinácii rastu rastlín, ale ich úloha v SAM (samostatnej morfologickej štruktúre) zostáva nedostatočne pochopená. V tejto štúdii sme vyvinuli ratiometrický biosenzor signalizácie GA modifikáciou proteínu PE tak, aby sa potlačila jeho základná regulačná funkcia v transkripčnej odpovedi GA a zároveň sa zachovala jeho degradácia po rozpoznaní GA. Preukázali sme, že tento biosenzor založený na degradácii presne zaznamenáva zmeny hladín GA a bunkového snímania počas vývoja. Tento biosenzor sme použili na mapovanie aktivity signalizácie GA v SAM. Ukázali sme, že vysoké signály GA sú prítomné prevažne v bunkách nachádzajúcich sa medzi orgánovými primordiami, ktoré sú prekurzormi internódiových buniek. Pomocou prístupov so ziskom a stratou funkcie ďalej demonštrujeme, že GA reguluje orientáciu roviny bunkového delenia, čím vytvára kanonickú bunkovú organizáciu internódií, a tým podporuje špecifikáciu internódií v SAM.
Apikálny meristém výhonku (SAM), ktorý sa nachádza na vrchole výhonku, obsahuje výklenok kmeňových buniek, ktorých aktivita generuje bočné orgány a kmeňové uzly modulárnym a iteratívnym spôsobom počas celého života rastliny. Každá z týchto opakujúcich sa jednotiek alebo rastlinných uzlov zahŕňa internódiá a bočné orgány v uzloch a axilárne meristémy v pazuchách listov1. Rast a organizácia rastlinných uzlov sa počas vývoja mení. U Arabidopsis je rast internódií počas vegetatívneho štádia potlačený a axilárne meristémy zostávajú dormantné v pazuchách listov ružice. Počas prechodu do kvetnej fázy sa SAM stáva kvetenský meristém, ktorý vytvára predĺžené internódiá a axilárne púčiky, vetvičky v pazuchách stonkových listov a neskôr bezlisté kvety2. Hoci sme dosiahli významný pokrok v chápaní mechanizmov, ktoré riadia vznik listov, kvetov a vetvičiek, o tom, ako vznikajú internódiá, sa vie relatívne málo.
Pochopenie časopriestorového rozloženia GA pomôže lepšie pochopiť funkcie týchto hormónov v rôznych tkanivách a v rôznych vývojových štádiách. Vizualizácia degradácie fúzie RGA-GFP exprimovanej pôsobením vlastného promótora poskytuje dôležité informácie o regulácii celkových hladín GA v koreňoch15,16. Expresia RGA sa však v jednotlivých tkanivách líši17 a je regulovaná GA18. Diferenciálna expresia promótora RGA teda môže viesť k fluorescenčnému vzoru pozorovanému pri RGA-GFP, a preto táto metóda nie je kvantitatívna. Nedávno bioaktívny fluoresceínom (Fl) značený GA19,20 odhalil akumuláciu GA v endokortexe koreňov a reguláciu jeho bunkových hladín transportom GA. Nedávno senzor GA FRET nlsGPS1 ukázal, že hladiny GA korelujú s predĺžením buniek v koreňoch, filamentoch a tmavo rastúcich hypokotyloch21. Ako sme však videli, koncentrácia GA nie je jediným parametrom, ktorý riadi signálnu aktivitu GA, pretože závisí od komplexných procesov snímania. V tejto práci, na základe nášho chápania signálnych dráh a GA, uvádzame vývoj a charakterizáciu degradačného ratiometrického biosenzora pre GA signalizáciu. Na vývoj tohto kvantitatívneho biosenzora sme použili mutantný GA-senzitívny RGA, ktorý bol fúzovaný s fluorescenčným proteínom a všadeprítomne exprimovaný v tkanivách, ako aj GA-necitlivý fluorescenčný proteín. Ukazujeme, že fúzie mutantných RGA proteínov neinterferujú s endogénnou GA signalizáciou, keď sú všadeprítomne exprimované, a že tento biosenzor dokáže kvantifikovať signálnu aktivitu vyplývajúcu zo vstupu GA aj zo spracovania GA signálu snímacím zariadením s vysokým priestorovo-časovým rozlíšením. Tento biosenzor sme použili na mapovanie priestorovo-časového rozloženia GA signálnej aktivity a kvantifikáciu toho, ako GA reguluje bunkové správanie v epiderme SAM. Preukazujeme, že GA reguluje orientáciu roviny delenia buniek SAM nachádzajúcich sa medzi orgánovými primordiami, čím definuje kanonickú bunkovú organizáciu internódia.
Nakoniec sme sa pýtali, či qmRGA dokáže hlásiť zmeny v hladinách endogénnej GA pomocou rastúcich hypokotylov. Predtým sme ukázali, že dusičnany stimulujú rast zvýšením syntézy GA a následne degradáciou34. V súlade s tým sme pozorovali, že dĺžka hypokotylu v sadeniciach pUBQ10::qmRGA pestovaných za hojného prísunu dusičnanov (10 mM NO3−) bola výrazne dlhšia ako v sadeniciach pestovaných v podmienkach s nedostatkom dusičnanov (doplnkový obrázok 6a). V súlade s rastovou odpoveďou boli signály GA vyššie v hypokotyloch sadeníc pestovaných v podmienkach 10 mM NO3− ako v sadeniciach pestovaných bez dusičnanov (doplnkový obrázok 6b, c). QmRGA teda umožňuje aj monitorovanie zmien v signalizácii GA vyvolaných endogénnymi zmenami v koncentrácii GA.
Aby sme pochopili, či signálna aktivita GA detegovaná pomocou qmRGA závisí od koncentrácie GA a vnímania GA, ako sa očakávalo na základe dizajnu senzora, analyzovali sme expresiu troch receptorov GID1 vo vegetatívnych a reprodukčných tkanivách. U sadeníc reportérová línia GID1-GUS ukázala, že GID1a a c boli vysoko exprimované v klíčnych listoch (obr. 3a–c). Okrem toho boli všetky tri receptory exprimované v listoch, laterálnych koreňových primordiách, koreňových špičkách (okrem koreňovej čiapočky GID1b) a cievnom systéme (obr. 3a–c). V SAM kvetenstva sme detegovali signály GUS iba pre GID1b a 1c (doplnkový obrázok 7a–c). Hybridizácia in situ potvrdila tieto expresné vzorce a ďalej preukázala, že GID1c bol rovnomerne exprimovaný na nízkych úrovniach v SAM, zatiaľ čo GID1b vykazoval vyššiu expresiu na periférii SAM (doplnkový obrázok 7d–l). Translačná fúzia pGID1b::2xmTQ2-GID1b tiež odhalila stupňovitý rozsah expresie GID1b, od nízkej alebo žiadnej expresie v strede SAM až po vysokú expresiu na okrajoch orgánov (doplnkový obrázok 7m). Receptory GID1 teda nie sú rovnomerne rozložené naprieč tkanivami a v rámci nich. V následných experimentoch sme tiež pozorovali, že nadmerná expresia GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) zvýšila citlivosť qmRGA v hypokotyloch na vonkajšiu aplikáciu GA (obr. 3d, e). Naproti tomu fluorescencia meraná pomocou qd17mRGA v hypokotyloch bola necitlivá na ošetrenie GA3 (obr. 3f, g). V oboch testoch boli sadenice ošetrené vysokými koncentráciami GA (100 μM GA3), aby sa posúdilo rýchle správanie senzora, kde sa schopnosť viazať sa na receptor GID1 zvýšila alebo stratila. Tieto výsledky spoločne potvrdzujú, že biosenzor qmRGA slúži ako kombinovaná funkcia senzora GA a GA a naznačujú, že diferenciálna expresia receptora GID1 môže významne modulovať emisivitu senzora.
Distribúcia signálov GA v SAM zostáva doteraz nejasná. Preto sme použili rastliny exprimujúce qmRGA a reportér kmeňových buniek pCLV3::mCherry-NLS35 na výpočet kvantitatívnych máp signálnej aktivity GA s vysokým rozlíšením, so zameraním na vrstvu L1 (epidermis; obr. 4a, b, pozri Metódy a doplnkové metódy), pretože L1 hrá kľúčovú úlohu v riadení rastu SAM36. Expresia pCLV3::mCherry-NLS v tomto prípade poskytla pevný geometrický referenčný bod pre analýzu priestorovo-časového rozloženia signálnej aktivity GA37. Hoci sa GA považuje za nevyhnutnú pre vývoj laterálnych orgánov4, pozorovali sme, že signály GA boli nízke v kvetnom primordiu (P) od štádia P3 (obr. 4a, b), zatiaľ čo mladé primordiá P1 a P2 mali miernu aktivitu podobnú aktivite v centrálnej oblasti (obr. 4a, b). Vyššia signálna aktivita GA bola detegovaná na hraniciach primordia orgánov, počnúc P1/P2 (na stranách hranice) a vrcholiac na P4, ako aj vo všetkých bunkách periférnej oblasti nachádzajúcej sa medzi primordiami (obr. 4a, b a doplnkový obr. 8a, b). Táto vyššia signálna aktivita GA bola pozorovaná nielen v epiderme, ale aj vo vrstvách L2 a hornej L3 (doplnkový obr. 8b). Vzorec signálov GA detegovaný v SAM pomocou qmRGA tiež zostal v priebehu času nezmenený (doplnkový obr. 8c–f, k). Hoci konštrukt qd17mRGA bol systematicky downregulovaný v SAM rastlín T3 z piatich nezávislých línií, ktoré sme podrobne charakterizovali, boli sme schopní analyzovať fluorescenčné vzory získané s konštruktom pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (doplnkový obr. 8g–j, l). V tejto kontrolnej línii boli v SAM detegované iba malé zmeny v pomere fluorescencie, ale v centre SAM sme pozorovali jasný a neočakávaný pokles VENUS asociovaný s TagBFP. Toto potvrdzuje, že signálny vzorec pozorovaný pomocou qmRGA odráža GA-dependentnú degradáciu mRGA-VENUS, ale tiež ukazuje, že qmRGA môže nadhodnocovať signálnu aktivitu GA v centre meristému. Stručne povedané, naše výsledky odhaľujú signálny vzorec GA, ktorý primárne odráža rozloženie primordií. Toto rozloženie interprimordiálnej oblasti (IPR) je spôsobené postupným vytváraním vysokej signálnej aktivity GA medzi vyvíjajúcim sa primordiom a centrálnou oblasťou, zatiaľ čo súčasne signálna aktivita GA v primordiu klesá (obr. 4c, d).
Distribúcia receptorov GID1b a GID1c (pozri vyššie) naznačuje, že diferenciálna expresia receptorov GA pomáha formovať vzorec signálnej aktivity GA v SAM. Zaujímalo nás, či by mohla byť zapojená diferenciálna akumulácia GA. Na preskúmanie tejto možnosti sme použili senzor nlsGPS1 GA FRET21. Zvýšená aktivačná frekvencia bola zistená v SAM nlsGPS1 ošetreného 10 μM GA4+7 počas 100 minút (doplnkový obrázok 9a–e), čo naznačuje, že nlsGPS1 reaguje na zmeny koncentrácie GA v SAM, rovnako ako v koreňoch21. Priestorové rozloženie aktivačnej frekvencie nlsGPS1 odhalilo relatívne nízke hladiny GA vo vonkajších vrstvách SAM, ale ukázalo sa, že boli zvýšené v strede a na okrajoch SAM (obr. 4e a doplnkový obrázok 9a,c). To naznačuje, že GA je tiež distribuovaná v SAM s priestorovým vzorom porovnateľným s tým, ktorý odhalil qmRGA. Ako doplnkový prístup sme SAM ošetrili aj fluorescenčným GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) alebo samotným Fl ako negatívnou kontrolou. Signál Fl bol distribuovaný v celom SAM vrátane centrálnej oblasti a primordia, aj keď s nižšou intenzitou (obr. 4j a doplnkový obr. 10d). Naproti tomu všetky tri GA-Fl sa akumulovali špecificky v rámci okrajov primordia a v rôznej miere aj vo zvyšku IPR, pričom GA7-Fl sa akumuloval v najväčšej doméne v IPR (obr. 4k a doplnkový obr. 10a,b). Kvantifikácia intenzity fluorescencie ukázala, že pomer intenzity IPR k intenzite bez IPR bol vyšší v SAM ošetrenom GA-Fl v porovnaní so SAM ošetreným Fl (obr. 4l a doplnkový obr. 10c). Tieto výsledky spoločne naznačujú, že GA je prítomný vo vyšších koncentráciách v bunkách IPR, ktoré sa nachádzajú najbližšie k okraju orgánu. To naznačuje, že vzorec signálnej aktivity SAM GA je výsledkom rozdielnej expresie receptorov GA aj rozdielnej akumulácie GA v bunkách IPR v blízkosti okrajov orgánov. Naša analýza teda odhalila neočakávaný priestorovo-časový vzorec GA signalizácie s nižšou aktivitou v centre a primordiu SAM a vyššou aktivitou v IPR v periférnej oblasti.
Aby sme pochopili úlohu diferenciálnej signálnej aktivity GA v SAM, analyzovali sme koreláciu medzi signálnou aktivitou GA, expanziou buniek a delením buniek pomocou časozberného zobrazovania SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS v reálnom čase. Vzhľadom na úlohu GA v regulácii rastu sa očakávala pozitívna korelácia s parametrami expanzie buniek. Preto sme najprv porovnali mapy signálnej aktivity GA s mapami rýchlosti rastu povrchu buniek (ako zástupca sily expanzie buniek pre danú bunku a pre dcérske bunky pri delení) a s mapami anizotropie rastu, ktorá meria smerovosť expanzie buniek (tiež použitá tu pre danú bunku a pre dcérske bunky pri delení; Obr. 5a,b, pozri Metódy a doplnkové metódy). Naše mapy rýchlosti rastu povrchu buniek SAM sú v súlade s predchádzajúcimi pozorovaniami38,39, s minimálnymi rýchlosťami rastu na hranici a maximálnymi rýchlosťami rastu vo vyvíjajúcich sa kvetoch (Obr. 5a). Analýza hlavných komponentov (PCA) ukázala, že signálna aktivita GA negatívne korelovala s intenzitou rastu povrchu buniek (Obrázok 5c). Taktiež sme ukázali, že hlavné osi variácie, vrátane vstupu GA signalizácie a intenzity rastu, boli ortogonálne na smer určený vysokou expresiou CLV3, čo potvrdzuje vylúčenie buniek z centra SAM v zostávajúcich analýzach. Spearmanova korelačná analýza potvrdila výsledky PCA (obrázok 5d), čo naznačuje, že vyššie GA signály v IPR neviedli k vyššej expanzii buniek. Korelačná analýza však odhalila miernu pozitívnu koreláciu medzi aktivitou GA signalizácie a anizotropiou rastu (obrázok 5c, d), čo naznačuje, že vyššia GA signalizácia v IPR ovplyvňuje smer rastu buniek a pravdepodobne aj polohu roviny bunkového delenia.
a, b Tepelné mapy priemerného rastu povrchu (a) a anizotropie rastu (b) v SAM spriemerované pre sedem nezávislých rastlín (použité ako ukazovatele sily a smeru expanzie buniek). c PCA analýza zahŕňala nasledujúce premenné: signál GA, intenzitu rastu povrchu, anizotropiu rastu povrchu a expresiu CLV3. Zložka PCA 1 negatívne korelovala s intenzitou rastu povrchu a pozitívne korelovala so signálom GA. Zložka PCA 2 pozitívne korelovala s anizotropiou rastu povrchu a negatívne korelovala s expresiou CLV3. Percentá predstavujú variáciu vysvetlenú každou zložkou. d Spearmanova korelačná analýza medzi signálom GA, intenzitou rastu povrchu a anizotropiou rastu povrchu v tkanivovej škále s výnimkou CZ. Číslo vpravo je Spearmanova hodnota rho medzi dvoma premennými. Hviezdičky označujú prípady, kde je korelácia/negatívna korelácia vysoko významná. e 3D vizualizácia buniek Col-0 SAM L1 konfokálnou mikroskopiou. Nové bunkové steny vytvorené v SAM (ale nie v primordiu) po 10 hodinách sú zafarbené podľa ich uhlových hodnôt. Farebný pruh je zobrazený v pravom dolnom rohu. Vložka zobrazuje zodpovedajúci 3D obraz v čase 0 h. Experiment sa dvakrát opakoval s podobnými výsledkami. f Krabicové grafy zobrazujú rýchlosti delenia buniek v IPR a non-IPR Col-0 SAM (n = 10 nezávislých rastlín). Stredová čiara zobrazuje medián a hranice rámčekov označujú 25. a 75. percentil. Fúzy označujú minimálne a maximálne hodnoty určené pomocou softvéru R. Hodnoty P boli získané pomocou Welchovho obojstranného t-testu. g, h Schematický diagram znázorňujúci (g) ako merať uhol novej bunkovej steny (purpurová) vzhľadom na radiálny smer od stredu SAM (biela bodkovaná čiara) (zohľadňujú sa iba hodnoty ostrého uhla, t. j. 0–90°) a (h) obvodový/laterálny a radiálny smer v rámci meristému. i Frekvenčné histogramy orientácie roviny delenia buniek naprieč SAM (tmavomodrá), IPR (stredne modrá) a non-IPR (svetlomodrá). Hodnoty P boli získané obojstranným Kolmogorov-Smirnovovým testom. Experiment bol dvakrát opakovaný s podobnými výsledkami. j Frekvenčné histogramy orientácie roviny bunkového delenia IPR okolo P3 (svetlozelená), P4 (stredne zelená) a P5 (tmavozelená). Hodnoty P boli získané obojstranným Kolmogorov-Smirnovovým testom. Experiment bol dvakrát opakovaný s podobnými výsledkami.
Preto sme ďalej skúmali koreláciu medzi signalizáciou GA a aktivitou bunkového delenia identifikáciou novovytvorených bunkových stien počas testu (Obr. 5e). Tento prístup nám umožnil merať frekvenciu a smer bunkového delenia. Prekvapivo sme zistili, že frekvencia bunkových delení v IPR a zvyšku SAM (bez IPR, Obr. 5f) bola podobná, čo naznačuje, že rozdiely v signalizácii GA medzi bunkami s IPR a bez IPR významne neovplyvňujú bunkové delenie. Toto a pozitívna korelácia medzi signalizáciou GA a anizotropiou rastu nás podnietili k úvahe, či by aktivita signalizácie GA mohla ovplyvniť orientáciu roviny bunkového delenia. Orientáciu novej bunkovej steny sme merali ako ostrý uhol vzhľadom na radiálnu os spájajúcu stred meristému a stred novej bunkovej steny (obr. 5e-i) a pozorovali sme jasnú tendenciu buniek deliť sa v uhloch blízkych 90° vzhľadom na radiálnu os, pričom najvyššie frekvencie boli pozorované pri 70–80° (23,28 %) a 80–90° (22,62 %) (obr. 5e,i), čo zodpovedá deleniu buniek v obvodovom/priečnom smere (obr. 5h). Aby sme preskúmali príspevok signalizácie GA k tomuto správaniu delenia buniek, analyzovali sme parametre delenia buniek v IPR a non-IPR samostatne (obr. 5i). Zistili sme, že rozloženie deliacich uhlov v bunkách IPR sa líšilo od rozloženia v bunkách bez IPR alebo v bunkách v celom SAM, pričom bunky IPR vykazovali vyšší podiel laterálnych/kruhových bunkových delení, tj 70–80° a 80–90° (33,86 % a 30,71 %, zodpovedajúce podiely) (Obr. 5i). Naše pozorovania teda odhalili súvislosť medzi vysokou GA signalizáciou a orientáciou roviny delenia buniek blízko obvodového smeru, podobnú korelácii medzi aktivitou GA signalizácie a anizotropiou rastu (Obr. 5c, d). Aby sme ďalej stanovili priestorovú konzerváciu tejto asociácie, merali sme orientáciu roviny delenia v bunkách IPR obklopujúcich primordium počnúc P3, pretože najvyššia aktivita GA signalizácie bola detegovaná v tejto oblasti počnúc P4 (Obr. 4). Deliace uhly IPR okolo P3 a P4 nevykazovali štatisticky významné rozdiely, hoci v IPR okolo P4 bola pozorovaná zvýšená frekvencia laterálnych bunkových delení (Obr. 5j). Avšak v bunkách IPR okolo P5 sa rozdiel v orientácii roviny bunkového delenia stal štatisticky významným s prudkým nárastom frekvencie priečnych bunkových delení (Obr. 5j). Tieto výsledky spoločne naznačujú, že signalizácia GA môže riadiť orientáciu bunkových delení v SAM, čo je v súlade s predchádzajúcimi správami40,41, že vysoká signalizácia GA môže indukovať laterálnu orientáciu bunkových delení v IPR.
Predpokladá sa, že bunky v IPR nebudú začlenené do primordií, ale skôr do internódií2,42,43. Priečna orientácia bunkových delení v IPR môže viesť k typickej organizácii paralelných pozdĺžnych radov epidermálnych buniek v internódiách. Naše pozorovania opísané vyššie naznačujú, že signalizácia GA pravdepodobne zohráva v tomto procese úlohu reguláciou smeru bunkového delenia.
Strata funkcie niekoľkých génov�DELLA vedie ku konštitutívnej GA odpovedi a na testovanie tejto hypotézy možno použiť mutanty della44. Najprv sme analyzovali expresné vzorce piatich génov�DELLA v SAM. Transkripčná fúzia línie GUS45 odhalila, že GAI, RGA, RGL1 a RGL2 (v oveľa menšej miere) boli exprimované v SAM (doplnkový obrázok 11a–d). In situ hybridizácia ďalej preukázala, že mRNA GAI sa akumuluje špecificky v primordiách a vyvíjajúcich sa kvetoch (doplnkový obrázok 11e). mRNA RGL1 a RGL3 boli detegované v celom poraste SAM a v starších kvetoch, zatiaľ čo mRNA RGL2 bola hojnejšia v hraničnej oblasti (doplnkový obrázok 11f–h). Konfokálne zobrazovanie pRGL3::RGL3-GFP SAM potvrdilo expresiu pozorovanú in situ hybridizáciou a ukázalo, že proteín RGL3 sa akumuluje v centrálnej časti SAM (doplnkový obrázok 11i). Pomocou línie pRGA::GFP-RGA sme tiež zistili, že proteín RGA sa akumuluje v SAM, ale jeho množstvo klesá na hranici od P4 (doplnkový obrázok 11j). Je pozoruhodné, že expresné vzorce RGL3 a RGA sú v súlade s vyššou signálnou aktivitou GA v IPR, ako bolo zistené pomocou qmRGA (obr. 4). Tieto údaje navyše naznačujú, že všetky DNA sú exprimované v SAM a že ich expresia kolektívne pokrýva celý SAM.
Ďalej sme analyzovali parametre bunkového delenia u divokého typu SAM (Ler, kontrola) a päťnásobných (globálnych) mutantov gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della (obr. 6a, b). Je zaujímavé, že sme pozorovali štatisticky významný posun v rozložení frekvencií uhlov bunkového delenia u globálneho mutanta SAM v porovnaní s divokým typom (obr. 6c). Táto zmena u globálneho mutanta bola spôsobená zvýšením frekvencie uhlov 80–90° (34,71 % oproti 24,55 %) a v menšej miere uhlov 70–80° (23,78 % oproti 20,18 %), tj zodpovedajúcich priečnym bunkovým deleniam (obr. 6c). Frekvencia nepriečnych delení (0–60°) bola tiež nižšia u globálneho mutanta della (obr. 6c). Frekvencia priečnych bunkových delení bola významne zvýšená u SAM globálneho mutanta della (obr. 6b). Frekvencia priečnych bunkových delení v IPR bola tiež vyššia u mutanta della global v porovnaní s divokým typom (obr. 6d). Mimo oblasti IPR mal divoký typ rovnomernejšie rozloženie uhlov bunkového delenia, zatiaľ čo mutant della global uprednostňoval tangenciálne delenia, ako je IPR (obr. 6e). Taktiež sme kvantifikovali orientáciu bunkových delení v SAM päťnásobných mutantov ga2 oxidázy (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 a ga2ox6-2), čo je mutantné pozadie neaktívne voči GA, v ktorom sa GA akumuluje. V súlade so zvýšením hladín GA bol SAM päťnásobného súkvetia mutanta ga2ox väčší ako SAM Col-0 (doplnkový obrázok 12a, b) a v porovnaní s Col-0 vykazoval päťnásobný ga2ox SAM výrazne odlišné rozloženie uhlov bunkového delenia, pričom frekvencia uhla sa zvyšovala z 50° na 90°, tj opäť v prospech tangenciálnych delení (doplnkový obrázok 12a–c). Ukazujeme teda, že konštitutívna aktivácia signalizácie GA a akumulácia GA indukujú laterálne bunkové delenia v IPR a zvyšku SAM.
a, b 3D vizualizácia vrstvy L1 SAM zafarbeného PI Ler (a) a globálneho mutanta della (b) pomocou konfokálnej mikroskopie. Zobrazené sú nové bunkové steny vytvorené v SAM (ale nie v primordiu) počas 10 hodín a zafarbené podľa ich hodnôt uhla. Vložka zobrazuje SAM v čase 0 h. Farebný pruh je zobrazený v pravom dolnom rohu. Šípka v (b) ukazuje na príklad zarovnaných bunkových súborov v globálnom mutante della. Experiment sa dvakrát opakoval s podobnými výsledkami. ce porovnanie frekvenčného rozloženia orientácií roviny bunkového delenia v celom SAM (d), IPR (e) a non-IPR (f) medzi Ler a globálnym mutantom della. Hodnoty P boli získané pomocou obojstranného Kolmogorov-Smirnovovho testu. f, g 3D vizualizácia konfokálnych obrazov SAM zafarbeného PI transgénnych rastlín Col-0 (i) a pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panely (a, b) zobrazujú nové bunkové steny (ale nie primordie) vytvorené v SAM do 10 hodín. Experiment sa dvakrát opakoval s podobnými výsledkami. h–j Porovnanie frekvenčného rozloženia orientácií roviny bunkového delenia nachádzajúcich sa v celom SAM (h), IPR (i) a non-IPR (j) medzi rastlinami Col-0 a pCUC2::gai-1-VENUS. Hodnoty P boli získané pomocou obojstranného Kolmogorov-Smirnovovho testu.
Ďalej sme testovali účinok inhibície GA signalizácie špecificky v IPR. Na tento účel sme použili promótor cotyledon cup 2 (CUC2) na riadenie expresie dominantne negatívneho proteínu gai-1 fúzovaného s VENUS (v línii pCUC2::gai-1-VENUS). V SAM divokého typu riadi promótor CUC2 expresiu väčšiny IPR v SAM, vrátane hraničných buniek, od P4 ďalej a podobná špecifická expresia bola pozorovaná v rastlinách pCUC2::gai-1-VENUS (pozri nižšie). Rozloženie uhlov bunkového delenia v SAM alebo IPR rastlín pCUC2::gai-1-VENUS sa významne nelíšilo od rozloženia uhlov divokého typu, hoci sme neočakávane zistili, že bunky bez IPR v týchto rastlinách sa delili s vyššou frekvenciou 80 – 90° (obr. 6f–j).
Bolo naznačené, že smer bunkového delenia závisí od geometrie SAM, najmä od ťahového napätia generovaného zakrivením tkaniva46. Preto sme sa pýtali, či sa tvar SAM zmenil u rastlín della global mutanta a pCUC2::gai-1-VENUS. Ako bolo uvedené predtým12, veľkosť SAM mutanta della global bola väčšia ako u divokého typu (doplnkový obrázok 13a, b, d). In situ hybridizácia CLV3 a STM RNA potvrdila expanziu meristému u mutantov della a ďalej ukázala laterálnu expanziu výklenku kmeňových buniek (doplnkový obrázok 13e, f, h, i). Zakrivenie SAM však bolo v oboch genotypoch podobné (doplnkový obrázok 13k, m, n, p). Podobné zväčšenie veľkosti sme pozorovali u štvornásobného mutanta gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della bez zmeny zakrivenia v porovnaní s divokým typom (doplnkový obrázok 13c, d, g, j, l, o, p). Frekvencia orientácie bunkového delenia bola tiež ovplyvnená u štvornásobného mutanta della, ale v menšej miere ako u monolitického mutanta della (doplnkový obrázok 12d–f). Tento dávkový účinok spolu s absenciou vplyvu na zakrivenie naznačuje, že zvyšková aktivita RGL3 u štvornásobného mutanta Della obmedzuje zmeny v orientácii bunkového delenia spôsobené stratou aktivity�***** a že zmeny v laterálnych bunkových deleniach sa vyskytujú v reakcii na zmeny v signálnej aktivite GA, a nie na zmeny v geometrii SAM. Ako je opísané vyššie, promótor CUC2 riadi expresiu IPR v SAM začínajúc od P4 (doplnkový obrázok 14a, b) a naopak, pCUC2::gai-1-VENUS SAM mal zmenšenú veľkosť, ale vyššie zakrivenie (doplnkový obrázok 14c–h). Táto zmena v morfológii pCUC2::gai-1-VENUS SAM môže viesť k odlišnému rozloženiu mechanických napätí v porovnaní s divokým typom, v ktorom vysoké obvodové napätia začínajú v kratšej vzdialenosti od centra SAM47. Alternatívne, zmeny v morfológii pCUC2::gai-1-VENUS SAM môžu byť výsledkom zmien v regionálnych mechanických vlastnostiach vyvolaných expresiou transgénu48. V oboch prípadoch by to mohlo čiastočne kompenzovať účinky zmien v GA signalizácii zvýšením pravdepodobnosti, že sa bunky budú deliť v cirkumferenčnej/priečnej orientácii, čo vysvetľuje naše pozorovania.
Naše údaje spoločne potvrdzujú, že vyššia GA signalizácia hrá aktívnu úlohu v laterálnej orientácii roviny bunkového delenia v IPR. Tiež ukazujú, že zakrivenie meristému tiež ovplyvňuje orientáciu roviny bunkového delenia v IPR.
Priečna orientácia roviny delenia v IPR v dôsledku vysokej aktivity signalizácie GA naznačuje, že GA preorganizuje radiálny bunkový súbor v epiderme v rámci SAM, aby definoval bunkovú organizáciu, ktorá sa neskôr nájde v epidermálnom internódiu. Takéto bunkové súbory boli skutočne často viditeľné na snímkach SAM mutantov della global (obr. 6b). Aby sme teda ďalej preskúmali vývojovú funkciu priestorového vzoru signalizácie GA v SAM, použili sme časozberné zobrazovanie na analýzu priestorovej organizácie buniek v IPR u transgénnych rastlín divokého typu (Ler a Col-0), mutantov della global a pCUC2::gai-1-VENUS.
Zistili sme, že qmRGA ukázala, že signálna aktivita GA v IPR sa zvýšila od P1/P2 a vrcholila pri P4 a tento vzorec zostal v priebehu času konštantný (obr. 4a–f a doplnkový obr. 8c–f, k). Aby sme analyzovali priestorovú organizáciu buniek v IPR so zvyšujúcim sa signálom GA, označili sme bunky Ler IPR nad a po stranách P4 podľa ich vývojového osudu analyzovaného 34 hodín po prvom pozorovaní, t. j. viac ako dva plastidové časy, čo nám umožnilo sledovať bunky IPR počas vývoja primordia od P1/P2 do P4. Použili sme tri rôzne farby: žltú pre bunky, ktoré boli integrované do primordia v blízkosti P4, zelenú pre tie, ktoré boli v IPR, a fialovú pre tie, ktoré sa zúčastnili oboch procesov (obr. 7a–c). V čase t0 (0 h) boli pred P4 viditeľné 1–2 vrstvy buniek IPR (obr. 7a). Ako sa očakávalo, keď sa tieto bunky delili, robili tak hlavne cez priečnu rovinu delenia (obr. 7a–c). Podobné výsledky sa dosiahli použitím Col-0 SAM (so zameraním na P3, ktorého okraj sa skladá podobne ako P4 u Ler), hoci v tomto genotype záhyb vytvorený na kvetnom okraji skryl bunky IPR rýchlejšie (Obr. 7g–i). Delenie buniek IPR teda predorganizuje bunky do radiálnych radov, ako v internódiách. Organizácia radiálnych radov a lokalizácia buniek IPR medzi po sebe idúcimi orgánmi naznačuje, že tieto bunky sú internodálnymi progenitormi.
V tejto štúdii sme vyvinuli pomerový biosenzor signálnej dráhy GA, qmRGA, ktorý umožňuje kvantitatívne mapovanie signálnej aktivity GA vyplývajúcej z kombinovaných koncentrácií GA a receptorov GA a zároveň minimalizuje interferenciu s endogénnymi signálnymi dráhami, čím poskytuje informácie o funkcii GA na bunkovej úrovni. Za týmto účelom sme skonštruovali modifikovaný proteín DNA, mRGA, ktorý stratil schopnosť viazať sa na interakčných partnerov DNA, ale zostáva citlivý na proteolýzu indukovanú GA. qmRGA reaguje na exogénne aj endogénne zmeny hladín GA a jeho dynamické snímacie vlastnosti umožňujú hodnotenie časopriestorových zmien signálnej aktivity GA počas vývoja. qmRGA je tiež veľmi flexibilný nástroj, pretože sa dá prispôsobiť rôznym tkanivám zmenou promótora použitého na jeho expresiu (ak je to potrebné) a vzhľadom na konzervatívnu povahu signálnej dráhy GA a motívu PFYRE naprieč krytosemennými rastlinami je pravdepodobné, že bude prenosný na iné druhy22. V súlade s tým sa ukázalo, že ekvivalentná mutácia v proteíne ryže SLR1 Helicobacter pylori (HYY497AAA) potláča aktivitu represora rastu SLR1, pričom len mierne znižuje jeho degradáciu sprostredkovanú GA, podobne ako v prípade mRGA23. Je pozoruhodné, že nedávne štúdie na Arabidopsis ukázali, že mutácia jednej aminokyseliny v doméne PFYRE (S474L) zmenila transkripčnú aktivitu RGA bez ovplyvnenia jej schopnosti interagovať s partnerskými transkripčnými faktormi50. Hoci je táto mutácia veľmi blízka 3 substitúciám aminokyselín prítomným v mRGA, naše štúdie ukazujú, že tieto dve mutácie menia odlišné vlastnosti . Hoci sa väčšina partnerských transkripčných faktorov viaže na domény LHR1 a SAW v 26,51, niektoré konzervované aminokyseliny v doméne PFYRE môžu pomôcť stabilizovať tieto interakcie.
Vývoj internódia je kľúčovým znakom v architektúre rastlín a zlepšení výnosu. qmRGA odhalila vyššiu signálnu aktivitu GA v progenitorových bunkách internódia IPR. Kombináciou kvantitatívneho zobrazovania a genetiky sme ukázali, že signálne vzory GA prekrývajú kruhové/priečne roviny bunkového delenia v epiderme SAM, čím formujú organizáciu bunkového delenia potrebnú pre vývoj internódia. Počas vývoja bolo identifikovaných niekoľko regulátorov orientácie roviny bunkového delenia52,53. Naša práca poskytuje jasný príklad toho, ako signálna aktivita GA reguluje tento bunkový parameter. môže interagovať s proteínovými komplexmi pred skladaním41, takže signalizácia GA môže regulovať orientáciu roviny bunkového delenia priamym ovplyvňovaním orientácie kortikálnych mikrotubulov40,41,54,55. Neočakávane sme ukázali, že v SAM korelát vyššej signálnej aktivity GA nebol predĺženie alebo delenie buniek, ale iba anizotropia rastu, čo je v súlade s priamym účinkom GA na smer bunkového delenia v IPR. Nemôžeme však vylúčiť, že tento účinok by mohol byť aj nepriamy, napríklad sprostredkovaný zmäkčením bunkovej steny indukovaným GA56. Zmeny vlastností bunkovej steny indukujú mechanické napätie57,58, ktoré môže tiež ovplyvniť orientáciu roviny bunkového delenia ovplyvnením orientácie kortikálnych mikrotubulov39,46,59. Kombinované účinky mechanického napätia indukovaného GA a priamej regulácie orientácie mikrotubulov pomocou GA môžu byť zapojené do generovania špecifického vzoru orientácie bunkového delenia v IPR na definovanie internódií a na overenie tejto myšlienky sú potrebné ďalšie štúdie. Podobne predchádzajúce štúdie zdôraznili dôležitosť proteínov TCP14 a 15 interagujúcich s DNA pri kontrole tvorby internódií60,61 a tieto faktory môžu sprostredkovať účinok GA spolu s BREVIPEDICELLUS (BP) a PENNYWISE (PNY), ktoré regulujú vývoj internódií a bolo preukázané, že ovplyvňujú signalizáciu GA2,62. Vzhľadom na to, žela interagujú so signálnymi dráhami brassinosteroidov, etylénu, kyseliny jasmónovej a kyseliny abscisovej (ABA)63,64 a že tieto hormóny môžu ovplyvňovať orientáciu mikrotubulov65, účinky GA na orientáciu bunkového delenia môžu byť sprostredkované aj inými hormónmi.
Včasné cytologické štúdie ukázali, že pre vývoj internódií sú potrebné vnútorné aj vonkajšie oblasti Arabidopsis SAM2,42. Skutočnosť, že GA aktívne reguluje bunkové delenie vo vnútorných tkanivách12, podporuje dvojitú funkciu GA pri regulácii veľkosti meristému a internódií v SAM. Vzor smerového bunkového delenia je tiež prísne regulovaný vo vnútornom tkanive SAM a táto regulácia je nevyhnutná pre rast stonky52. Bude zaujímavé preskúmať, či GA zohráva úlohu aj v orientácii roviny bunkového delenia vo vnútornej organizácii SAM, čím synchronizuje špecifikáciu a vývoj internódií v rámci SAM.
Rastliny boli pestované in vitro v pôde alebo v médiu 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) doplnenom o 1 % sacharózy a 1 % agaru (Sigma) za štandardných podmienok (16 h svetlo, 22 °C), s výnimkou experimentov s hypokotylom a rastom koreňov, v ktorých boli sadenice pestované na vertikálnych platniach za konštantného svetla a 22 °C. Pre experimenty s dusičnanmi boli rastliny pestované na modifikovanom MS médiu (rastlinné médium bioWORLD) doplnenom o dostatočné množstvo dusičnanov (0 alebo 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinátu, 1 % sacharózy a 1 % A-agaru (Sigma) za podmienok dlhého dňa.
cDNA GID1a vložená do pDONR221 bola rekombinovaná s pDONR P4-P1R-pUBQ10 a pDONR P2R-P3-mCherry do pB7m34GW za vzniku pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2 vložená do pDONR221 bola rekombinovaná do pB7RWG266 za vzniku p35S:IDD2-RFP. Na vytvorenie pGID1b::2xmTQ2-GID1b sa najprv amplifikoval 3,9 kb fragment pred kódujúcou oblasťou GID1b a 4,7 kb fragment obsahujúci cDNA GID1b (1,3 kb) a terminátor (3,4 kb) pomocou primerov v doplnkovej tabuľke 3 a potom sa vložil do pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) a pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) v uvedenom poradí a nakoniec sa rekombinoval s pDONR221 2xmTQ268 do cieľového vektora pGreen 012567 pomocou klonovania Gateway. Na vytvorenie pCUC2::LSSmOrange bola do vektora zameraného na kanamycín pGreen zostavená promótorová sekvencia CUC2 (3229 bp upstream od ATG), po ktorej nasledovala kódujúca sekvencia veľkého Stokesovo posunutého mOrange (LSSmOrange)69 s nukleárnym lokalizačným signálom N7 a transkripčným terminátorom NOS. Binárny vektor pre rastliny bol zavedený do kmeňa Agrobacterium tumefaciens GV3101 a do listov Nicotiana benthamiana infiltračnou metódou Agrobacterium a do Arabidopsis thaliana Col-0 metódou floral dip. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry a pCLV3::mCherry-NLS qmRGA boli izolované z potomstva F3 a F1 príslušných krížení.
RNA in situ hybridizácia sa uskutočnila na približne 1 cm dlhých špičkách výhonkov72, ktoré sa zozbierali a okamžite fixovali v roztoku FAA (3,7 % formaldehyd, 5 % kyselina octová, 50 % etanol) predchladenom na 4 °C. Po 2 × 15 minútach vákuového ošetrenia sa fixatív vymenil a vzorky sa inkubovali cez noc. cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 a RGL3 a antisense sondy k ich 3′-UTR sa syntetizovali pomocou primerov uvedených v doplnkovej tabuľke 3, ako opísali Rosier a kol.73. Digoxigenínom značené sondy boli imunodetekované pomocou digoxigenínových protilátok (3000-násobné riedenie; Roche, katalógové číslo: 11 093 274 910) a rezy boli farbené roztokom 5-bróm-4-chlór-3-indolylfosfátu (BCIP, 250-násobné riedenie)/nitromodrej tetrazolia (NBT, 200-násobné riedenie).
Čas uverejnenia: 10. februára 2025