V tejto štúdii boli stimulačné účinky kombinovanej liečbyregulátory rastu rastlínBol skúmaný vplyv nanočastíc (2,4-D a kinetínu) a oxidu železa (Fe₃O₄-NP) na morfogenézu in vitro a produkciu sekundárnych metabolitov v *Hypericum perforatum* L. Optimalizovaná liečba [2,4-D (0,5 mg/l) + kinetín (2 mg/l) + Fe₃O₄-NP (4 mg/l)] významne zlepšila rastové parametre rastlín: výška rastliny sa zvýšila o 59,6 %, dĺžka koreňov o 114,0 %, počet púčikov o 180,0 % a čerstvá hmotnosť kalusu o 198,3 % v porovnaní s kontrolnou skupinou. Táto kombinovaná liečba tiež zvýšila účinnosť regenerácie (50,85 %) a zvýšila obsah hypericínu o 66,6 %. Analýza GC-MS odhalila vysoký obsah hyperozidu, β-patolénu a cetylalkoholu, čo predstavuje 93,36 % celkovej plochy píku, zatiaľ čo obsah celkových fenolov a flavonoidov sa zvýšil až o 80,1 %. Tieto výsledky naznačujú, že regulátory rastu rastlín (PGR) a nanočastice Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NP) vykazujú synergický účinok stimuláciou organogenézy a akumuláciou bioaktívnych zlúčenín, čo predstavuje sľubnú stratégiu pre biotechnologické zlepšenie liečivých rastlín.
Ľubovník bodkovaný (Hypericum perforatum L.), tiež známy ako ľubovník bodkovaný, je trváca bylina z čeľade Hypericaceae, ktorá má ekonomickú hodnotu.[1] Medzi jej potenciálne bioaktívne zložky patria prírodné triesloviny, xantóny, floroglucinol, naftaléndiantrón (hyperín a pseudohyperín), flavonoidy, fenolové kyseliny a éterické oleje.[2,3,4] Ľubovník bodkovaný sa môže množiť tradičnými metódami; sezónnosť tradičných metód, nízka klíčivosť semien a náchylnosť na choroby však obmedzujú jej potenciál pre pestovanie vo veľkom meradle a nepretržitú tvorbu sekundárnych metabolitov.[1,5,6]
Preto sa kultivácia tkanív in vitro považuje za účinnú metódu rýchleho rozmnožovania rastlín, zachovania zdrojov zárodočnej plazmy a zvýšenia výťažku liečivých zlúčenín [7, 8]. Regulátory rastu rastlín (PGR) zohrávajú kľúčovú úlohu v regulácii morfogenézy a sú nevyhnutné pre kultiváciu kalusu a celých organizmov in vitro. Optimalizácia ich koncentrácií a kombinácií je kľúčová pre úspešné dokončenie týchto vývojových procesov [9]. Preto je pochopenie vhodného zloženia a koncentrácie regulátorov dôležité pre zlepšenie rastu a regeneračnej schopnosti ľubovníka bodkovaného (H. perforatum) [10].
Nanočastice oxidu železa (Fe₃O₄) sú triedou nanočastíc, ktoré boli alebo sa vyvíjajú pre tkanivové kultúry. Fe₃O₄ má významné magnetické vlastnosti, dobrú biokompatibilitu a schopnosť podporovať rast rastlín a znižovať environmentálny stres, preto priťahuje značnú pozornosť v dizajne tkanivových kultúr. Potenciálne aplikácie týchto nanočastíc môžu zahŕňať optimalizáciu kultivácie in vitro na podporu bunkového delenia, zlepšenie príjmu živín a aktiváciu antioxidačných enzýmov [11].
Hoci nanočastice preukázali dobré podporné účinky na rast rastlín, štúdie o kombinovanej aplikácii nanočastíc Fe₃O₄ a optimalizovaných regulátorov rastu rastlín u *H. perforatum* zostávajú nedostatočné. Aby sa vyplnila táto medzera vo vedomostiach, táto štúdia vyhodnotila účinky ich kombinovaných účinkov na morfogenézu in vitro a produkciu sekundárnych metabolitov s cieľom poskytnúť nové poznatky na zlepšenie vlastností liečivých rastlín. Preto má táto štúdia dva ciele: (1) optimalizovať koncentráciu regulátorov rastu rastlín na účinnú podporu tvorby kalusu, regenerácie výhonkov a zakoreňovania in vitro; a (2) vyhodnotiť účinky nanočastíc Fe₃O₄ na rastové parametre in vitro. Budúce plány zahŕňajú vyhodnotenie miery prežitia regenerovaných rastlín počas aklimatizácie (in vitro). Očakáva sa, že výsledky tejto štúdie významne zlepšia účinnosť mikropropagácie *H. perforatum*, čím prispejú k udržateľnému využívaniu a biotechnologickým aplikáciám tejto dôležitej liečivej rastliny.
V tejto štúdii sme získali listové explantáty z jednoročných rastlín ľubovníka bodkovaného pestovaných na poli (materské rastliny). Tieto explantáty boli použité na optimalizáciu podmienok kultivácie in vitro. Pred kultiváciou boli listy dôkladne opláchnuté pod tečúcou destilovanou vodou niekoľko minút. Povrchy explantátov boli potom dezinfikované ponorením do 70 % etanolu na 30 sekúnd a následným ponorením do 1,5 % roztoku chlórnanu sodného (NaOCl) obsahujúceho niekoľko kvapiek Tween 20 na 10 minút. Nakoniec boli explantáty trikrát opláchnuté sterilnou destilovanou vodou pred prenosom do ďalšieho kultivačného média.
Počas nasledujúcich štyroch týždňov sa merali parametre regenerácie výhonkov vrátane rýchlosti regenerácie, počtu výhonkov na explantát a dĺžky výhonku. Keď regenerované výhonky dosiahli dĺžku aspoň 2 cm, boli prenesené do zakoreňovacieho média pozostávajúceho z polovičnej koncentrácie MS média, 0,5 mg/l kyseliny indolmaslovej (IBA) a 0,3 % guarovej gumy. Kultivácia zakoreňovania pokračovala tri týždne, počas ktorých sa merala rýchlosť zakoreňovania, počet koreňov a dĺžka koreňov. Každé ošetrenie sa opakovalo trikrát, pričom sa na jedno opakovanie kultivovalo 10 explantátov, čo viedlo k približne 30 explantátom na ošetrenie.
Výška rastliny sa merala v centimetroch (cm) pomocou pravítka, od základne rastliny po špičku najvyššieho listu. Dĺžka koreňa sa merala v milimetroch (mm) bezprostredne po starostlivom vybratí sadeníc a odstránení pestovateľského média. Počet púčikov na explantát sa spočítal priamo na každej rastline. Počet čiernych škvŕn na listoch, známych ako uzlíky, sa meral vizuálne. Predpokladá sa, že tieto čierne uzlíky sú žľazy obsahujúce hypericín alebo oxidačné škvrny a používajú sa ako fyziologický indikátor reakcie rastliny na ošetrenie. Po odstránení všetkého pestovateľského média sa čerstvá hmotnosť sadeníc merala pomocou elektronickej váhy s presnosťou na miligramy (mg).
Metóda výpočtu rýchlosti tvorby kalusu je nasledovná: po kultivácii explantátov v médiu obsahujúcom rôzne rastové regulátory (kinázy, 2,4-D a Fe3O4) počas štyroch týždňov sa spočíta počet explantátov schopných tvoriť kalus. Vzorec na výpočet rýchlosti tvorby kalusu je nasledovný:
Každé ošetrenie sa opakovalo trikrát, pričom v každom opakovaní sa skúmalo najmenej 10 explantátov.
Rýchlosť regenerácie odráža podiel kalusového tkaniva, ktoré úspešne dokončí proces diferenciácie púčikov po fáze tvorby kalusu. Tento ukazovateľ preukazuje schopnosť kalusového tkaniva transformovať sa na diferencované tkanivo a rásť do nových rastlinných orgánov.
Koeficient zakoreňovania je pomer počtu vetiev schopných zakoreniť sa k celkovému počtu vetiev. Tento ukazovateľ odráža úspešnosť fázy zakoreňovania, ktorá je kľúčová pri mikropropagácii a rozmnožovaní rastlín, pretože dobré zakoreňovanie pomáha sadeniciam lepšie prežiť v rastových podmienkach.
Hypericínové zlúčeniny boli extrahované 90 % metanolom. Päťdesiat mg sušeného rastlinného materiálu bolo pridaných do 1 ml metanolu a sonikovaných 20 minút pri 30 kHz v ultrazvukovom čističi (model A5120-3YJ) pri izbovej teplote v tme. Po sonikácii bola vzorka centrifugovaná pri 6000 ot./min. počas 15 minút. Supernatant bol zozbieraný a absorbancia hypericínu bola meraná pri 592 nm pomocou spektrofotometra Plus-3000 S podľa metódy opísanej Conceiçaom a kol. [14].
Väčšina ošetrení regulátormi rastu rastlín (PGR) a nanočasticami oxidu železa (Fe₃O₄-NP) nespôsobila tvorbu čiernych uzlíkov na regenerovaných listoch výhonkov. Pri žiadnom z ošetrení s 0,5 alebo 1 mg/l 2,4-D, 0,5 alebo 1 mg/l kinetínu alebo 1, 2 alebo 4 mg/l nanočastíc oxidu železa sa nepozorovali žiadne uzlíky. Niekoľko kombinácií preukázalo mierny nárast vývoja uzlíkov (ale nie štatisticky významný) pri vyšších koncentráciách kinetínu a/alebo nanočastíc oxidu železa, ako napríklad kombinácia 2,4-D (0,5 – 2 mg/l) s kinetínom (1 – 1,5 mg/l) a nanočasticami oxidu železa (2 – 4 mg/l). Tieto výsledky sú znázornené na obrázku 2. Čierne uzlíky predstavujú žľazy bohaté na hypericín, ktoré sa vyskytujú prirodzene aj sú prospešné. V tejto štúdii boli čierne uzlíky spojené najmä s hnednutím tkanív, čo naznačuje priaznivé prostredie pre akumuláciu hypericínu. Ošetrenie nanočasticami 2,4-D, kinetínu a Fe₃O₄ podporilo rast kalusu, znížilo hnednutie a zvýšilo obsah chlorofylu, čo naznačuje zlepšenú metabolickú funkciu a potenciálne zníženie oxidačného poškodenia [37]. Táto štúdia hodnotila účinky kinetínu v kombinácii s nanočasticami 2,4-D a Fe₃O₄ na rast a vývoj kalusu ľubovníka bodkovaného (obr. 3a–g). Predchádzajúce štúdie ukázali, že nanočastice Fe₃O₄ majú antifungálne a antimikrobiálne účinky [38, 39] a pri použití v kombinácii s regulátormi rastu rastlín môžu stimulovať obranné mechanizmy rastlín a znižovať indexy bunkového stresu [18]. Hoci je biosyntéza sekundárnych metabolitov geneticky regulovaná, ich skutočný výťažok je vysoko závislý od podmienok prostredia. Metabolické a morfologické zmeny môžu ovplyvniť hladiny sekundárnych metabolitov reguláciou expresie špecifických rastlinných génov a reakciou na faktory prostredia. Okrem toho môžu induktory spustiť aktiváciu nových génov, ktoré následne stimulujú enzymatickú aktivitu, čo v konečnom dôsledku aktivuje viacero biosyntetických dráh a vedie k tvorbe sekundárnych metabolitov. Ďalšia štúdia ďalej ukázala, že zníženie tienenia zvyšuje vystavenie slnečnému žiareniu, čím sa zvyšujú denné teploty v prirodzenom prostredí *Hypericum perforatum*, čo tiež prispieva k zvýšenému výťažku hypericínu. Na základe týchto údajov táto štúdia skúmala úlohu nanočastíc železa ako potenciálnych induktorov v tkanivových kultúrach. Výsledky ukázali, že tieto nanočastice môžu aktivovať gény zapojené do biosyntézy hesperidínu prostredníctvom enzymatickej stimulácie, čo vedie k zvýšenej akumulácii tejto zlúčeniny (Obr. 2). Preto v porovnaní s rastlinami rastúcimi v prirodzených podmienkach možno tvrdiť, že produkcia takýchto zlúčenín in vivo sa môže tiež zvýšiť, keď sa mierny stres spojí s aktiváciou génov zapojených do biosyntézy sekundárnych metabolitov. Kombinované ošetrenia majú vo všeobecnosti pozitívny vplyv na rýchlosť regenerácie, ale v niektorých prípadoch je tento účinok oslabený. Je pozoruhodné, že ošetrenie 1 mg/l 2,4-D, 1,5 mg/l kinázy a rôznymi koncentráciami by mohlo nezávisle a významne zvýšiť rýchlosť regenerácie o 50,85 % v porovnaní s kontrolnou skupinou (Obr. 4c). Tieto výsledky naznačujú, že špecifické kombinácie nanohormónov môžu pôsobiť synergicky a podporovať rast rastlín a produkciu metabolitov, čo má veľký význam pre tkanivové kultúry liečivých rastlín. Palmer a Keller [50] ukázali, že ošetrenie 2,4-D by mohlo nezávisle indukovať tvorbu kalusu v St. perforatum, zatiaľ čo pridanie kinázy významne zvýšilo tvorbu a regeneráciu kalusu. Tento účinok bol spôsobený zlepšením hormonálnej rovnováhy a stimuláciou bunkového delenia. Bal a kol. [51] zistili, že ošetrenie Fe₃O₄-NP by mohlo nezávisle zvýšiť funkciu antioxidačných enzýmov, čím by podporilo rast koreňov v St. perforatum. Kultivačné médiá obsahujúce nanočastice Fe₃O₄ v koncentráciách 0,5 mg/l, 1 mg/l a 1,5 mg/l zlepšili rýchlosť regenerácie ľanových rastlín [52]. Použitie kinetínu, 2,4-dichlórbenzotiazolinónu a nanočastíc Fe₃O₄ významne zlepšilo rýchlosť tvorby kalusu a koreňov, je však potrebné zvážiť potenciálne vedľajšie účinky použitia týchto hormónov na regeneráciu in vitro. Napríklad dlhodobé alebo vysoko koncentrované používanie 2,4-dichlórbenzotiazolinónu alebo kinetínu môže viesť k somatickej klonálnej variácii, oxidačnému stresu, abnormálnej morfológii kalusu alebo vitrifikácii. Vysoká miera regenerácie preto nemusí nevyhnutne predpovedať genetickú stabilitu. Všetky regenerované rastliny by sa mali hodnotiť pomocou molekulárnych markerov (napr. RAPD, ISSR, AFLP) alebo cytogenetickej analýzy, aby sa určila ich homogenita a podobnosť s rastlinami in vivo [53,54,55].
Táto štúdia po prvýkrát preukázala, že kombinované použitie regulátorov rastu rastlín (2,4-D a kinetínu) s nanočasticami Fe₃O₄ môže zvýšiť morfogenézu a akumuláciu kľúčových bioaktívnych metabolitov (vrátane hypericínu a hyperozidu) v *Hypericum perforatum*. Optimalizovaný liečebný režim (1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l kinetínu + 4 mg/l Fe₃O₄-NP) nielen maximalizoval tvorbu kalusu, organogenézu a výťažok sekundárnych metabolitov, ale preukázal aj mierny indukčný účinok, ktorý potenciálne zlepšuje toleranciu rastliny voči stresu a jej liečivú hodnotu. Kombinácia nanotechnológie a tkanivovej kultúry rastlín poskytuje udržateľnú a efektívnu platformu pre rozsiahlu in vitro produkciu liečivých zlúčenín. Tieto výsledky pripravujú cestu pre priemyselné aplikácie a budúci výskum molekulárnych mechanizmov, optimalizácie dávkovania a genetickej presnosti, čím sa prepája základný výskum liečivých rastlín s praktickou biotechnológiou.
Čas uverejnenia: 12. decembra 2025