Antihelmintikum N,N-dietyl-m-toluamid (DEET) údajne inhibuje AChE (acetylcholínesterázu) a má potenciálne karcinogénne vlastnosti v dôsledku nadmernej vaskularizácie. V tejto práci ukazujeme, že DEET špecificky stimuluje endotelové bunky, ktoré podporujú angiogenézu, čím zvyšuje rast nádoru. DEET aktivuje bunkové procesy vedúce k angiogenéze, vrátane proliferácie, migrácie a adhézie. To je spojené so zvýšenou produkciou NO a expresiou VEGF v endotelových bunkách. Utlmenie M3 alebo použitie farmakologických inhibítorov M3 zrušilo všetky tieto účinky, čo naznačuje, že angiogenéza indukovaná DEET je citlivá na M3. Experimenty zahŕňajúce vápnikovú signalizáciu v endotelových a HEK bunkách s nadmernou expresiou M3 receptorov, ako aj štúdie väzby a dokovania, naznačujú, že DEET pôsobí ako alosterický modulátor M3 receptorov. Okrem toho DEET inhibuje AChE, čím zvyšuje biologickú dostupnosť acetylcholínu a jeho väzbu na M3 receptory a zvyšuje proangiogénne účinky prostredníctvom alosterickej regulácie.
Primárne EC boli izolované z aorty švajčiarskych myší. Metóda extrakcie bola adaptovaná z Kobayashiho protokolu26. Myšie EC boli kultivované v médiu EBM-2 doplnenom o 5 % tepelne inaktivovaného FBS až do štvrtej pasáže.
Vplyv dvoch koncentrácií DEET na proliferáciu HUVEC, U87MG alebo BF16F10 sa analyzoval pomocou súpravy CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Stručne povedané, 5.103 buniek na jamku sa naočkovalo do 96-jamkovej platne, nechalo sa cez noc prichytiť a potom sa na ne pôsobilo DEET 24 hodín. Po odstránení rastového média sa do každej jamky mikroplatne pridal roztok viažuci farbivo a bunky sa inkubovali pri teplote 37 °C počas 30 minút. Hladiny fluorescencie sa stanovili pomocou multimódového čítača mikroplatní Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Nemecko) vybaveného excitačnými filtrami 485 nm a emisnými filtrami 530 nm.
HUVEC boli nasiate do 96-jamkových platní v hustote 104 buniek na jamku. Bunky boli ošetrené DEET počas 24 hodín. Životaschopnosť buniek bola stanovená kolorimetrickým MTT testom (Sigma-Aldrich, M5655). Hodnoty optickej hustoty boli získané na multimódovom čítači mikroplatní (Mithras LB940) pri vlnovej dĺžke 570 nm.
Účinky DEET boli študované pomocou in vitro testov angiogenézy. Liečba s 10-8 M alebo 10-5 M DEET zvýšila tvorbu kapilárnej dĺžky v HUVEC (obr. 1a, b, biele stĺpce). V porovnaní s kontrolnou skupinou, liečba koncentráciami DEET v rozmedzí od 10-14 do 10-5 M ukázala, že dĺžka kapilár dosiahla plató pri 10-8 M DEET (doplnkový obrázok S2). Nebol zistený žiadny významný rozdiel v proangiogénnom účinku HUVEC ošetrených DEET in vitro v koncentračnom rozmedzí 10-8 M a 10-5 M.
Na stanovenie vplyvu DEET na neovaskularizáciu sme vykonali in vivo štúdie neovaskularizácie. Po 14 dňoch myši, ktorým boli injekčne podané endotelové bunky predkultivované s 10-8 M alebo 10-5 M DEET, vykazovali významný nárast obsahu hemoglobínu (obr. 1c, biele stĺpce).
Okrem toho bola študovaná neovaskularizácia indukovaná DEET u myší s xenograftom U87MG, ktorým bol denne (ip) injekčne podávaný DEET v dávke, o ktorej je známe, že indukuje plazmatické koncentrácie 10-5 M, čo je normálne u exponovaných ľudí. v 23. Detekovateľné nádory (t. j. nádory > 100 mm3) boli pozorované 14 dní po injekcii buniek U87MG myšiam. Na 28. deň bol rast nádoru u myší liečených DEET významne zvýšený v porovnaní s kontrolnými myšami (obr. 1d, štvorce). Okrem toho, farbenie nádorov CD31 ukázalo, že DEET významne zvýšil plochu kapilár, ale nie hustotu mikrociev. (obr. 1e–g).
Na stanovenie úlohy muskarínových receptorov v proliferácii indukovanej DETA sa použilo 10⁻⁶ M alebo 10⁻⁶ M DETA v prítomnosti pFHHSiD (10⁻⁶ M, selektívny antagonista M3 receptora). Ošetrenie HUVEC pomocou pFHHSiD úplne blokovalo proliferačné vlastnosti DETA pri všetkých koncentráciách (Tabuľka 1).
Za týchto podmienok sme tiež skúmali, či DEET zvýši dĺžku kapilár v bunkách HUVEC. Podobne pFHHSiD významne zabránil zväčšeniu dĺžky kapilár vyvolanej DEET (obr. 1a, b, sivé stĺpce). Podobné experimenty boli vykonané aj s M3 siRNA. Hoci kontrolná siRNA nebola účinná pri podpore tvorby kapilár, umlčanie muskarínového receptora M3 zrušilo schopnosť DEET zväčšovať dĺžku kapilár (obr. 1a, b, čierne stĺpce).
Okrem toho, pFHHSiD úplne blokoval vaskularizáciu in vitro aj neovaskularizáciu in vivo indukovanú 10-8 M alebo 10-5 M DEET (obr. 1c, d, krúžky). Tieto výsledky naznačujú, že DEET podporuje angiogenézu prostredníctvom dráhy citlivej na selektívne antagonisty M3 receptora alebo M3 siRNA.
AChE je molekulárny cieľ DEET. Lieky ako donepezil, ktoré pôsobia ako inhibítory AChE, môžu stimulovať angiogenézu endotelových buniek in vitro a na modeloch ischémie zadných končatín myší14. Testovali sme vplyv dvoch koncentrácií DEET na aktivitu enzýmu AChE v HUVEC. Nízke (10-8 M) a vysoké (10-5 M) koncentrácie DEET znížili aktivitu endotelovej AChE v porovnaní s kontrolnými podmienkami (obr. 2).
Obe koncentrácie DEET (10-8 M a 10-5 M) znížili aktivitu acetylcholínesterázy na HUVEC. BW284c51 (10-5 M) sa použil ako kontrola pre inhibítory acetylcholínesterázy. Výsledky sú vyjadrené ako percento aktivity AChE na HUVEC ošetrených dvoma koncentráciami DEET v porovnaní s bunkami ošetrenými vehikulom. Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± SEM zo šiestich nezávislých experimentov. *p < 0,05 v porovnaní s kontrolou (Kruskal-Wallisov a Dunnov test viacnásobného porovnania).
Oxid dusnatý (NO) sa podieľa na angiogénnom procese 33, preto sa skúmala produkcia NO v bunkách HUVEC stimulovaných DEET. Produkcia endotelového NO ošetrená DEET sa zvýšila v porovnaní s kontrolnými bunkami, ale dosiahla významnosť až pri dávke 10-8 M (Obr. 3c). Na stanovenie molekulárnych zmien kontrolujúcich produkciu NO indukovanú DEET sa analyzovala expresia a aktivácia eNOS pomocou Western blottingu. Hoci liečba DEET nezmenila expresiu eNOS, významne zvýšila fosforyláciu eNOS v jeho aktivačnom mieste (Ser-1177), pričom znížila jeho inhibičné miesto (Thr-495) v porovnaní s neošetrenými bunkami pri fosforylácii eNOS (Obr. 3d). Okrem toho sa po normalizácii množstva fosforylovaného eNOS k celkovému množstvu enzýmu vypočítal pomer fosforylovaného eNOS v aktivačnom mieste a inhibičnom mieste. Tento pomer sa významne zvýšil v bunkách HUVEC ošetrených každou koncentráciou DEET v porovnaní s neošetrenými bunkami (Obr. 3d).
Nakoniec bola expresia VEGF, jedného z hlavných proangiogénnych faktorov, analyzovaná Western blottingom. DEET významne zvýšil expresiu VEGF, zatiaľ čo pFHHSiD túto expresiu úplne blokoval.
Keďže účinky DEET sú citlivé na farmakologickú blokádu aj na zníženie regulácie M3 receptorov, testovali sme hypotézu, že DEET by mohol zosilniť vápnikovú signalizáciu. Prekvapivo, DEET nedokázal zvýšiť cytoplazmatický vápnik v HUVEC (údaje nie sú uvedené) a HEK/M3 (obr. 4a, b) pri oboch použitých koncentráciách.
Čas uverejnenia: 30. decembra 2024