Antihelmintikum N,N-dietyl-m-toluamid (DEET) bolo hlásené, že inhibuje AChE (acetylcholínesterázu) a má potenciálne karcinogénne vlastnosti v dôsledku nadmernej vaskularizácie. V tomto článku ukazujeme, že DEET špecificky stimuluje endotelové bunky, ktoré podporujú angiogenézu, čím zvyšuje rast nádoru. DEET aktivuje bunkové procesy vedúce k angiogenéze, vrátane proliferácie, migrácie a adhézie. Toto je spojené so zvýšenou produkciou NO a expresiou VEGF v endotelových bunkách. Umlčanie M3 alebo použitie farmakologických inhibítorov M3 zrušilo všetky tieto účinky, čo naznačuje, že angiogenéza indukovaná DEET je citlivá na M3. Experimenty zahŕňajúce vápnikovú signalizáciu v endotelových a HEK bunkách nadmerne exprimujúcich M3 receptory, ako aj väzbové a dokovacie štúdie naznačujú, že DEET pôsobí ako alosterický modulátor M3 receptorov. Okrem toho DEET inhibuje AChE, čím zvyšuje biologickú dostupnosť acetylcholínu a jeho väzbu na M3 receptory a zvyšuje proangiogénne účinky prostredníctvom alosterickej regulácie.
Primárne EC boli izolované z aorty švajčiarskych myší. Metóda extrakcie bola upravená z Kobayashiho protokolu26. Myšie EC sa kultivovali v médiu EBM-2 doplnenom 5 % tepelne inaktivovaným FBS až do štvrtej pasáže.
Účinok dvoch koncentrácií DEET na proliferáciu HUVEC, U87MG alebo BF16F10 sa analyzoval pomocou súpravy CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Stručne, 5,103 buniek na jamku sa naočkovalo na 96-jamkovú doštičku, nechalo sa prichytiť cez noc a potom sa ošetrilo DEET počas 24 hodín. Po odstránení rastového média pridajte roztok viažuci farbivo do každej jamky mikroplatničky a inkubujte bunky pri 37 °C počas 30 minút. Úrovne fluorescencie sa stanovili pomocou multimódovej čítačky mikrodoštičiek Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Nemecko) vybavenej 485 nm excitačnými filtrami a 530 nm emisnými filtrami.
HUVEC sa naočkovali na 96-jamkové doštičky v hustote 104 buniek na jamku. Bunky boli ošetrené DEET počas 24 hodín. Životaschopnosť buniek bola hodnotená použitím kolorimetrického MTT testu (Sigma-Aldrich, M5655). Hodnoty optickej hustoty sa získali na multimódovej čítačke mikrodoštičiek (Mithras LB940) pri vlnovej dĺžke 570 nm.
Účinky DEET boli študované pomocou in vitro testov angiogenézy. Ošetrenie 10-8 M alebo 10-5 M DEET zvýšilo tvorbu dĺžky kapilár v HUVEC (obr. 1a, b, biele stĺpce). V porovnaní s kontrolnou skupinou liečba s koncentráciami DEET v rozmedzí od 10-14 do 10-5 M ukázala, že dĺžka kapiláry dosiahla plató pri 10-8 M DEET (doplnkový obrázok S2). Nezistil sa žiadny významný rozdiel v in vitro proangiogénnom účinku HUVEC ošetrených DEET v koncentračnom rozsahu 10-8 M a 10-5 M.
Aby sme určili účinok DEET na neovaskularizáciu, uskutočnili sme in vivo neovaskularizačné štúdie. Po 14 dňoch myši, ktorým boli injikované endotelové bunky predkultivované s 10-8 M alebo 10-5 M DEET, vykazovali významné zvýšenie obsahu hemoglobínu (obr. 1c, biele stĺpce).
Okrem toho sa neovaskularizácia indukovaná DEET študovala u myší s xenoštepom U87MG, ktorým sa denne (ip) injekčne podával DEET v dávke, o ktorej je známe, že indukuje plazmatické koncentrácie 10-5 M, čo je normálne u exponovaných ľudí. v 23. Detegovateľné nádory (tj nádory >100 mm3) boli pozorované 14 dní po injekcii buniek U87MG myšiam. V deň 28 bol rast nádoru významne zvýšený u myší liečených DEET v porovnaní s kontrolnými myšami (obr. 1d, štvorce). Okrem toho farbenie nádorov CD31 ukázalo, že DEET významne zvýšil kapilárnu oblasť, ale nie hustotu mikrociev. (obr. 1e–g).
Na stanovenie úlohy muskarínových receptorov v DETA-indukovanej proliferácii sa použilo 10-8 M alebo 10-5 M DETA v prítomnosti pFHHSiD (10-7 M, selektívny antagonista M3 receptora). Liečba HUVEC. pFHHSiD úplne blokoval proliferačné vlastnosti DETA pri všetkých koncentráciách (tabuľka 1).
Za týchto podmienok sme tiež skúmali, či by DEET zvýšil dĺžku kapilár v bunkách HUVEC. Podobne pFHHSiD významne zabránil dĺžke kapiláry indukovanej DEET (obr. 1a, b, sivé stĺpce). Okrem toho sa podobné experimenty uskutočnili s M3 siRNA. Hoci kontrolná siRNA nebola účinná pri podpore tvorby kapilár, umlčanie M3 muskarínového receptora zrušilo schopnosť DEET zväčšiť dĺžku kapilár (obr. 1a, b, čierne stĺpce).
Okrem toho 10-8 M alebo 10-5 M DEET-indukovaná vaskularizácia in vitro aj neovaskularizácia in vivo boli úplne blokované pFHHSiD (obr. lc, d, krúžky). Tieto výsledky naznačujú, že DEET podporuje angiogenézu prostredníctvom dráhy citlivej na selektívne antagonisty M3 receptora alebo M3 siRNA.
AChE je molekulárnym cieľom DEET. Lieky ako donepezil, ktoré pôsobia ako inhibítory AChE, môžu stimulovať EC angiogenézu in vitro a na modeloch ischémie zadných končatín u myší14. Testovali sme účinok dvoch koncentrácií DEET na aktivitu enzýmu AChE v HUVEC. Nízke (10-8 M) a vysoké (10-5 M) koncentrácie DEET znižovali endotelovú aktivitu AChE v porovnaní s kontrolnými podmienkami (obr. 2).
Obe koncentrácie DEET (10-8 M a 10-5 M) znížili aktivitu acetylcholínesterázy na HUVEC. BW284c51 (10-5 M) sa použil ako kontrola pre inhibítory acetylcholínesterázy. Výsledky sú vyjadrené ako percento aktivity AChE na HUVEC ošetrených dvoma koncentráciami DEET v porovnaní s bunkami ošetrenými vehikulom. Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± SEM zo šiestich nezávislých experimentov. *p < 0,05 v porovnaní s kontrolou (Kruskal-Wallis a Dunn viacnásobný porovnávací test).
Oxid dusnatý (NO) sa podieľa na angiogénnom procese 33, preto sa študovala produkcia NO v DEET-stimulovaných HUVEC. Produkcia endotelového NO po ošetrení DEET bola zvýšená v porovnaní s kontrolnými bunkami, ale významnosť dosiahla len pri dávke 10-8 M (obr. 3c). Na stanovenie molekulárnych zmien kontrolujúcich produkciu NO indukovanú DEET sa analyzovala expresia a aktivácia eNOS pomocou Western blottingu. Hoci liečba DEET nezmenila expresiu eNOS, významne zvýšila fosforyláciu eNOS na jeho aktivačnom mieste (Ser-1177) a zároveň znížila jeho inhibičné miesto (Thr-495) v porovnaní s neošetrenými bunkami pri fosforylácii eNOS (obr. 3d). Okrem toho sa pomer fosforylovaného eNOS v aktivačnom mieste a inhibičnom mieste vypočítal po normalizácii množstva fosforylovaného eNOS k celkovému množstvu enzýmu. Tento pomer bol významne zvýšený v HUVEC ošetrených každou koncentráciou DEET v porovnaní s neošetrenými bunkami (obr. 3d).
Nakoniec sa expresia VEGF, jedného z hlavných proangiogénnych faktorov, analyzovala Western blotom. DEET významne zvýšil expresiu VEGF, zatiaľ čo pFHHSiD túto expresiu úplne blokoval.
Pretože účinky DEET sú citlivé na farmakologickú blokádu aj downreguláciu M3 receptorov, testovali sme hypotézu, že DEET môže zvýšiť vápnikovú signalizáciu. Prekvapivo DEET nedokázal zvýšiť cytoplazmatický vápnik v HUVEC (údaje nie sú uvedené) a HEK/M3 (obr. 4a, b) pre obe použité koncentrácie.
Čas odoslania: 30. decembra 2024