Huba spôsobujúca spálenie ryže Kosakonia oryziphila NP19 sa môže použiť ako stimulátor rastu rastlín a biologický pesticíd na potlačenie spálenia ryže odrody KDML105.

Táto štúdia dokazuje, že rizosférická symbiotická huba *Kosakonia oryziphila* NP19 izolovaná z koreňov ryže je sľubným biopesticídom podporujúcim rast rastlín a biopesticídom na kontrolu spály ryže spôsobenej *Pyricularia oryzae*. Experimenty in vitro boli vykonané na čerstvých listoch sadeníc jazmínovej ryže odrody Khao Dawk Mali 105 (KDML105). Výsledky ukázali, že NP19 účinne inhiboval klíčenie konídií *Pyricularia oryzae*. Infekcia *Pyricularia oryzae* bola inhibovaná za troch rôznych podmienok ošetrenia: po prvé, ryža bola kolonizovaná s NP19 a inokulovaná konídiami *Pyricularia oryzae*; po druhé, na listy bola aplikovaná zmes NP19 a konídií *Pyricularia oryzae*;
Baktéria rizosféry *Kosakonia oryziphila* NP19¹⁴bol izolovaný z koreňov ryže (*Oryza sativa* L. cv. RD6). *Kosakonia oryziphila* NP19 má vlastnosti podporujúce rast rastlín vrátane fixácie dusíka, produkcie kyseliny indoleoctovej (IAA) a solubilizácie fosfátov. Je zaujímavé, že *Kosakonia oryziphila* NP19 produkuje chitinázu^14.Aplikácia *Kosakonia oryziphila* NP19 na semená ryže KDML105 zlepšila prežitie ryže po infekcii ryžovou hubovou chorobou. Cieľom tejto štúdie je (i) objasniť inhibičný mechanizmus *Kosakonia oryziphila* NP19 proti ryžovej hubovej chorobe a (ii) preskúmať účinok *Kosakonia oryziphila* NP19 na kontrolu ryžovej hubovej choroby.

Živiny zohrávajú kľúčovú úlohu v raste a vývoji rastlín a slúžia ako faktory, ktoré kontrolujú rôzne mikrobiálne choroby. Minerálna výživa rastliny určuje jej odolnosť voči chorobám, morfologické alebo tkanivové vlastnosti a virulenciu, čiže schopnosť prežiť proti patogénom. Fosfor môže spomaliť vývoj a znížiť závažnosť spály ryže zvýšením syntézy fenolických zlúčenín. Draslík vo všeobecnosti znižuje výskyt mnohých chorôb ryže, ako je spála ryže, bakteriálna škvrnitosť listov, škvrnitosť pošvy listov, hniloba stonky a škvrnitosť listov. Štúdia Perrenouda ukázala, že hnojivá s vysokým obsahom draslíka môžu tiež znížiť výskyt hubových chorôb ryže a zvýšiť výnos. Početné štúdie ukázali, že sírne hnojivá môžu zlepšiť odolnosť plodín voči hubovým patogénom.²⁷Nadbytok horčíka (súčasť chlorofylu) môže viesť k ryžovej explózii.²¹Zinok môže priamo ničiť patogény, čím znižuje závažnosť ochorenia.²²Poľné pokusy ukázali, že hoci koncentrácie fosforu, draslíka, síry a zinku v poľnej pôde boli vyššie ako v kvetináčovom experimente, spála ryže sa stále šírila cez listy ryže. Živiny z pôdy nemusia byť veľmi účinné pri kontrole spály ryže, pretože relatívna vlhkosť a teplota sú nepriaznivé pre silné zamorenie patogénmi.
V poľných pokusoch boli vo všetkých ošetreniach zistené Stenotrophomonas maltophilia, P. dispersa, Xanthomonas sacchari, Burkholderia multivorans, Burkholderia diffusa, Burkholderia vietnamiensis a C. gleum. Stenotrophomonas maltophilia bola izolovaná z rizosféry pšenice, ovsa, uhorky, kukurice a zemiakov a preukázala biokontrolu.^aktivitaproti Colletotrichum nymphaeae.28 Okrem toho sa uvádza, že P. dispersa je účinná proti čiernej^hnilobasladký zemiak.29 Okrem toho kmeň R1 Xanthomonas sacchari preukázal antagonistickú aktivitu proti spále ryže a hnilobe laty spôsobenej Burkholderia^glumae.30Burkholderia oryzae NP19 môže počas klíčenia nadviazať symbiotický vzťah s tkanivom ryže a stať sa endemickou symbiotickou hubou pre niektoré odrody ryže. Zatiaľ čo iné pôdne baktérie môžu kolonizovať ryžu po presadení, huba spôsobujúca chorobu NP19 po kolonizácii ovplyvňuje viacero faktorov v obrannom mechanizme ryže proti tejto chorobe. NP19 nielenže potláča rast P. oryzae o viac ako 50 % (pozri doplnkovú tabuľku S1 v online dodatku), ale tiež znižuje počet lézií spôsobených chorobou na listoch a zvyšuje výnos ryže inokulovanej alebo kolonizovanej NP19 (RBf, RFf-B a RBFf-B) v poľných pokusoch (obrázok S3).
Huba Pyricularia oryzae, ktorá spôsobuje chorobu rastlín, je hemitrófna huba, ktorá počas infekcie vyžaduje živiny z hostiteľskej rastliny. Rastliny produkujú reaktívne formy kyslíka (ROS) na potlačenie hubovej infekcie; Pyricularia oryzae však používa rôzne stratégie na potlačenie ROS produkovaných hostiteľom.³¹Zdá sa, že peroxidázy hrajú úlohu v rezistencii voči patogénom, vrátane zosieťovania proteínov bunkovej steny, zhrubnutia stien xylému, produkcie ROS a neutralizácie peroxidu vodíka.³²Antioxidačné enzýmy môžu slúžiť ako špecifický systém na zachytávanie ROS. Superoxiddismutáza (SOD) a peroxidáza (POD) vďaka svojim antioxidačným vlastnostiam pomáhajú iniciovať obranné reakcie, pričom SOD slúži ako prvá obranná línia.³³V ryži sa aktivita rastlinnej peroxidázy indukuje po infekcii rastlinnými patogénmi, ako sú *Pyricularia oryzae* a *Xanthomonas oryzae pv. Oryzae*.³²V tejto štúdii sa aktivita peroxidázy zvýšila u ryže kolonizovanej a/alebo inokulovanej *Magnaporthe oryzae* NP19; avšak *Magnaporthe oryzae* neovplyvnil aktivitu peroxidázy. Superoxiddismutáza (SOD), ako H₂O₂ syntáza, katalyzuje redukciu O₂⁻ na H₂O₂. SOD hrá kľúčovú úlohu v odolnosti rastlín voči rôznym stresom tým, že vyrovnáva koncentráciu H₂O₂ vo vnútri rastliny, čím zvyšuje toleranciu rastlín voči rôznym stresom³⁴. V tejto štúdii, v kvetináčovom experimente, 30 dní po inokulácii *Magnaporthe oryzae* (30 DAT), bola aktivita SOD v skupinách RF a RBF o 121,9 % a 104,5 % vyššia ako v skupine R, čo naznačuje reakciu SOD na infekciu *Magnaporthe oryzae*. V kvetinových aj poľných experimentoch bola aktivita SOD v ryži inokulovanej *Magnaporthe oryzae* NP19 o 67,7 % a 28,8 % vyššia ako v nenaočkovanej ryži 30 dní po inokulácii. Biochemické reakcie rastlín sú ovplyvnené prostredím, zdrojom stresu a typom rastliny³⁵. Aktivitu rastlinných antioxidačných enzýmov priamo ovplyvňujú faktory prostredia, ktoré zase ovplyvňujú aktivitu rastlinných antioxidačných enzýmov zmenou rastlinnej mikrobiálnej komunity.
V tejto štúdii bola použitá huba spôsobujúca spálu ryže (Kosakonia oryziphila NP19, prístupové číslo NCBI PP861312) kmeňa¹³izolovaný z koreňov ryže kultivaru RD6 v provincii Nakhon Phanom, Thajsko (16° 59′ 42,9″ N 104° 22′ 17,9″ E). Tento kmeň bol kultivovaný v živnom bujóne (NB) pri teplote 30 °C a 150 ot./min. počas 18 hodín. Na výpočet bakteriálnej koncentrácie bola meraná absorbancia bakteriálnej suspenzie pri 600 nm. Koncentrácia bakteriálnej suspenzie bola upravená na^10⁶CFU/ml so sterilnou deionizovanou vodou (_dH₂O). Ryžová spála (Pyricularia oryzae) bola bodovo naočkovaná na zemiakový dextrózový agar (PDA) a inkubovaná pri teplote 25 °C počas 7 dní. Hubové mycélium bolo prenesené na agarové médium z ryžových otrúb (2 % (hm./obj.) ryžové otruby, 0,5 % (hm./obj.) sacharóza a 2 % (hm./obj.) agar rozpustený v deionizovanej vode, pH 7) a inkubované pri teplote 25 °C počas 7 dní. Sterilizovaný list náchylného kultivaru ryže (KDML105) bol umiestnený na mycélium, aby sa indukovali konídie, a inkubovaný pri teplote 25 °C počas 5 dní pod kombinovaným UV a bielym svetlom. Konídie boli zozbierané jemným utretím mycélia a infikovaného povrchu listu 10 ml sterilizovaného 0,025 % (v/v) roztoku Tween 20. Hubový roztok bol prefiltrovaný cez osem vrstiev gázy, aby sa odstránilo mycélium, agar a ryžové listy. Koncentrácia konídií v suspenzii bola upravená na 5 × 10⁵ konídií/ml pre ďalšiu analýzu.
Čerstvé kultúry buniek Kosakonia oryziphila NP19 boli pripravené kultiváciou v NB médiu pri teplote 37 °C počas 24 hodín. Po centrifugácii (3047 × g, 10 min) bol bunkový pelet zozbieraný, dvakrát premytý 10 mM fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS, pH 7,2) a resuspendovaný v rovnakom pufri. Optická hustota bunkovej suspenzie bola meraná pri 600 nm, pričom sa dosiahla hodnota približne 1,0 (ekvivalent 1,0 × 10⁷ CFU/μl stanovená nanesením na živné agarové platne). Konídie P. oryzae boli získané ich suspendovaním v PBS roztoku a spočítaním pomocou hemocytometra. Suspenzie *K. oryziphila* NP19 a *P. Pre experimenty s roztermi z listov boli konídie K. oryziphila* pripravené na čerstvých listoch ryže v koncentráciách 1,0 × 10⁷ CFU/μl a 5,0 × 10² konídií/μl. Metóda prípravy vzorky ryže bola nasledovná: 5 cm dlhé listy zo sadeníc ryže boli odrezané a umiestnené do Petriho misiek vystlaných navlhčeným savým papierom. Bolo vytvorených päť ošetrovaných skupín: (i) R: listy ryže bez bakteriálnej inokulácie ako kontrola, doplnené 0,025 % (v/v) roztokom Tween 20; (ii) RB + F: ryža inokulovaná K. oryziphila NP19, doplnená 2 μl suspenzie konídií huby spôsobujúcej pálenie ryže; (iii) R + BF: Ryža v skupine R doplnená 4 μl zmesi suspenzie konídií huby spôsobujúcej pálenie ryže a K. oryziphila NP19 (objemový pomer 1:1); (iv) R + F: Ryža v skupine R doplnená o 2 μl suspenzie konídií húb; (v) RF + B: Ryža v skupine R doplnená o 2 μl suspenzie konídií húb bola inkubovaná 30 hodín a potom boli na to isté miesto pridané 2 μl K. oryziphila NP19. Všetky Petriho misky boli inkubované pri teplote 25 °C v tme počas 30 hodín a potom umiestnené pod nepretržité svetlo. Každá skupina bola vytvorená v troch opakovaniach. Po 72 hodinách kultivácie boli rastlinné tkanivá pozorované a analyzované skenovacou elektrónovou mikroskopiou (SEM). Stručne povedané, rastlinné tkanivá boli fixované vo fosfátovom pufri obsahujúcom 2,5 % (v/v) glutaraldehydu a dehydratované pomocou série etanolových roztokov. Po vysušení v kritických bodoch oxidom uhličitým boli vzorky potiahnuté naprašovaním zlata a nakoniec preskúmané pomocou skenovacieho elektrónového mikroskopu.¹⁵