Pesticídy zohrávajú kľúčovú úlohu pri riešení globálneho nedostatku potravín a v boji proti chorobám prenášaným vektormi u ľudí. Rastúci problém rezistencie voči pesticídom si však naliehavo vyžaduje objavenie nových zlúčenín, ktoré cielia na nedostatočne využívané ciele. Kanály TRPV (Insect transient receptor potential) – Nanzhong (Nan) a inaktívne (Iav) – môžu tvoriť heterológne kanály (Nan-Iav) a lokalizovať sa v mechanosenzorických orgánoch, ktoré sprostredkovávajú geotropizmus, sluch a propriocepciu u hmyzu. Niektoré pesticídy, ako napríklad afidopyrolidón (AP), cielia na Nan-Iav prostredníctvom neznámych mechanizmov. AP je účinný proti bodavo-cicavému hmyzu (hemipterans), pričom bráni kŕmeniu narušením funkcie filamentov. AP sa môže viazať iba na Nan, ale iba Nan-Iav môže interagovať s agonistami vrátane endogénneho nikotínamidu (NAM), čím vykazuje aktivitu kanálov. Napriek potenciálu Nan-Iav ako cieľa insekticídov je málo známe o jeho zostavovaní kanálov, regulačných väzbových miestach a regulácii závislej od Ca2+, čo bráni ďalšiemu vývoju insekticídov. V tejto štúdii bola použitá kryoelektrónová mikroskopia na určenie štruktúry Nan-Iav u hmyzu Hemiptera v stave bez kalmodulínového ligandu, ako aj s AP a NAM na hranici cytoplazmatickej domény ankyrínových repetic (ARD). Prekvapivo sme zistili, že samotný proteín Nan môže tvoriť pentamér, ktorý je stabilizovaný interakciami ARD sprostredkovanými AP. Táto štúdia odhaľuje molekulárne interakcie medzi insekticídmi a agonistami a Nan-Iav, zdôrazňuje dôležitosť ARD vo funkcii a zostavovaní kanálov a skúma mechanizmus regulácie Ca2+.
Vzhľadom na čoraz závažnejšie globálne klimatické zmeny je zhoršujúca sa globálna potravinová bezpečnosť jednou z hlavných výziev 21. storočia s kaskádovými dôsledkami pre spoločnosť.1,2Správa Svetovej zdravotníckej organizácie o stave potravinovej bezpečnosti a výživy vo svete v roku 2023 (SOFI) odhaduje, že približne 2,33 miliardy ľudí na celom svete trpí stredne ťažkou až ťažkou potravinovou neistotou, čo je dlhodobý problém.3,4Bohužiaľ, odhadom sa každoročne stráca 20 % až 30 % alebo viac úrody plodín kvôli škodcom a patogénom a očakáva sa, že globálne otepľovanie zhorší odolnosť voči škodcom a zraniteľnosť plodín.4, 5, 6, 7, 8Vývoj pesticídov je kľúčový nielen na ochranu plodín pred škodcami a zníženie šírenia patogénov prenášaných vektormi, ale aj na boj proti chorobám prenášaným vektormi u ľudí, ako je horúčka dengue, malária a Chagasova choroba, ktoré sú čoraz odolnejšie voči pesticídom.5, 9, 10, 11
Medzi hlavnými cieľmi neurotoxických insekticídov predstavuje heterotetramérny TRPV kanál Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) triedu cieľov insekticídov objavených až v poslednom desaťročí, vrátane komerčne dostupných insekticídov, ako sú imidakloprid a pyraklostrobín.12, 13, 14Polosyntetický insekticíd afidopyrolifén (AP) je nedávno vyvinutý a komerčne dostupný produkt, ktorého hlavnou zložkou je aktívny insekticíd Inscalis®, ktorý viaže AP na subnanomolárnej úrovni aktivity.15AP vykazuje nízku akútnu toxicitu pre opeľovače, užitočný hmyz a iné necieľové organizmy a pri použití podľa pokynov na etikete môže znížiť odolnosť voči iným insekticídom.16, 17, 18Nan a Iav sú široko rozšírené medzi druhmi hmyzu, sú koexprimované iba v neurónoch receptorov chordálneho natiahnutia tykadiel a končatín a sú kritické pre sluch, vnímanie gravitácie a propriocepciu.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidakloprid a pyraklostrobín stimulujú komplex Nan-Iav prostredníctvom jedinečného mechanizmu, čím v konečnom dôsledku inhibujú proprioceptívnu signálnu transdukciu.13, 16, 23U hmyzu sajúceho bodavým spôsobom (hemiptera), ako sú vošky a molice, strata propriocepcie zhoršuje ich schopnosť kŕmenia, čo nakoniec vedie k smrti.13,24Je zaujímavé, že AP vykazuje vysokú afinitu ku komplexu Nan-Iav a nízku afinitu k samotnému Nan. Väzba AP na Nan-Iav indukuje elektrický prúd, ale väzba na samotný Nan nestimuluje aktivitu kanála. Samotný Iav sa vôbec neviaže na AP.16To naznačuje, že Nan a Iav sa môžu viazať za vzniku rôznych kanálových komplexov Nan-Iav (napr. s rôznymi stechiometrickými pomermi alebo rôznymi usporiadaniami v rámci rovnakého stechiometrického pomeru) alebo že AP sa môže viazať na viacero miest. Okrem toho sa prirodzený agonista nikotínamid (NAM) viaže na Drosophila Nan-Iav s mikromolárnou afinitou, pričom vykazuje účinky podobné účinkom vošiek (AP) in vitro.16,25a potláčanie rozmnožovania a kŕmenia vošiek, čo v konečnom dôsledku vedie k ich smrti25,26Tieto údaje vyvolávajú mnoho otázok. Napríklad zostáva nejasné, ako sa tvorí heterodimér Nan-Iav, ktoré väzbové miesta sa používajú na moduláciu malých molekúl a ako tieto malé molekuly regulujú funkciu kanálov potlačením propriocepcie. Okrem toho zostávajú nejasné dôvody, prečo je samotný Nan neaktívny a má nízku afinitu k AP, zatiaľ čo heterodimér Nan-Iav je aktívny a viaže sa na AP s vyššou afinitou. Nakoniec je málo známe o regulácii funkcie Nan-Iav závislej od Ca2+ a o tom, ako je integrovaná do neuronálnych signálnych procesov.13,21
V tejto štúdii sme kombináciou kryoelektrónovej mikroskopie, elektrofyziológie a techník viazania rádioligandov objasnili zostavenie Nan-Iav a mechanizmus jeho väzby na regulátory s malými molekulami. Okrem toho sme detegovali konštitutívne viazaný kalmodulín (CaM) na Iav a AP-stabilizované Nan pentaméry. Tieto výsledky poskytujú dôležité poznatky o regulácii vápnikových iónov v kanáloch, zostavení kanálov a faktoroch určujúcich väzbovú afinitu ligandu. A čo je dôležitejšie, potvrdili sme, že ARD hrá v týchto procesoch ústrednú úlohu. Naša štúdia kompletných hmyzích kanálov viazaných na relevantné poľnohospodárske pesticídy27, 28, 29otvára perspektívy rozvoja pesticídneho priemyslu, zlepšuje účinnosť a špecifickosť pesticídov a umožňuje aplikáciu zlúčenín zameraných na TRPV na iné druhy s cieľom riešiť globálnu potravinovú bezpečnosť a šírenie chorôb prenášaných vektormi.
Zistili sme tiež, že Nan-Iav je regulovaný Ca2+ a mechanizmus regulácie je sprostredkovaný konštitutívne viazaným CaM. Dôležité je, že táto Ca2+-závislá regulácia Nav pomocou CaM sa výrazne líši od mechanizmov regulácie iných iónových kanálov (napr. napäťovo riadených Na+ kanálov a TRPV5/6 kanálov).52, 53, 54, 55, 56, 57V kanáli Nav1.2 sa C-terminálna doména CaM helikálne spája s C-terminálnou doménou (CTD) a Ca2+ indukuje väzbu svojej N-terminálnej domény na distálnu časť CTD.56V kanáli TRPV5/6 sa C-terminálna doména CaM viaže na CTH a Ca2+ indukuje predĺženie svojej N-terminálnej domény smerom nahor do póru, čím blokuje priepustnosť katiónov.53,54Navrhujeme model pre Ca2+-regulovanú funkciu Nan-Iav-CaM (Obr. 4h). V tomto modeli sa N-terminálna doména CaM konštitutívne viaže na C-terminálnu doménu (CTH) Iav. V pokojovom stave (nízka koncentrácia [Ca2+]) C-terminálna doména CaM interaguje s Nan, čím stabilizuje konformáciu ARD a tým podporuje otvorenie kanála. Väzba agonistu/insekticídu na kanál indukuje otvorenie pórov, čo vedie k prítoku Ca2+. Ca2+ sa potom viaže na CaM, čo spôsobuje disociáciu C-terminálnej domény od ARD Nan. Pretože blokovanie väzby CaM v podstate ruší inhibičný účinok Ca2+, táto disociácia moduluje mobilitu ARD, čím spôsobuje inhibíciu alebo desenzibilizáciu závislú od Ca2+. Rýchla obnova kanálových prúdov po elúcii vápnikových iónov (Obr. 4g) naznačuje, že tento mechanizmus uľahčuje rýchle reakcie na Ca2+-sprostredkované neuronálne signály. Okrem toho sa uvádza, že C-terminálna oblasť Iav, ktorá je stále nedostatočne pochopená, zohráva aj ďalšie úlohy v zacielení kanálov a regulácii prúdu.21
Naša štúdia nakoniec predstavuje štruktúru s vysokým rozlíšením komplexu TRP kanálov insekticídov a insekticídov s poľnohospodárskym významom – objav, ktorý nám bol doteraz neznámy. Je pozoruhodné, že sme charakterizovali štruktúru a funkciu hmyzieho kanála v ľudských bunkách (HEK293S GnTi–) a nie v hmyzích bunkách. Vzhľadom na rastúcu rezistenciu voči insekticídom a pretrvávajúci tlak na potravinovú bezpečnosť a patogény naša práca poskytuje dôležité informácie, ktoré uľahčia vývoj nových insekticídov v prospech ľudského zdravia a globálnej potravinovej bezpečnosti. Štúdie ukázali, že insekticídy, ako napríklad AP, sú účinné proti niektorým škodcom, ak sa používajú podľa pokynov na etikete, a majú nízku akútnu toxicitu pre užitočné opeľovače, čo dokazuje ich environmentálnu bezpečnosť.13,16Okrem toho testovanie niektorých derivátov AP na komároch ukázalo, že nakoniec strácajú schopnosť lietať. Pochopenie toho, ako sa tieto modulačné zlúčeniny viažu na Nan-Iav, uľahčí modifikáciu existujúcich zlúčenín alebo vývoj nových zlúčenín pre účinnejšie a...presnýkontrola škodcov. Naša štúdia dokazuje, že rozhranie Nan-Iav ARD je kľúčové nielen pre reguláciu aktivity endogénnych zlúčenín, pesticídov a Ca2+-CaM, ale aj pre zostavovanie kanálov. Navrhujeme, že narušenie zostavovania heterodimérov malými molekulami môže byť jedinečným a sľubným prístupom k vývoju inhibítorov iónových kanálov.
Z ôsmich ortologických génov boli vybrané gény hnedého chrobáka (Halyomorpha halys) Nanchung a Inactive s plnou dĺžkou, ktoré vykazujú vynikajúcu stabilitu v detergentoch. Syntetizované gény boli optimalizované z hľadiska kodónov pre ľudskú expresiu a klonované do vektora pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) s použitím reštrikčných miest XhoI a EcoRI. To zabezpečilo, že klony boli v rámci s C-terminálnymi značkami GFP-FLAG-10xHis a mCherry-FLAG-10xHis, ktoré sú štiepené proteázou HRC-3C (PPX), čo umožňuje nezávislé...výrazPriméry použité na klonovanie Nanchung a Inactive do vektora pBacMam boli nasledovné:
Mikroskopické snímky jednotlivých častíc boli získané na transmisnom elektrónovom mikroskope Titan Krios G2 (FEI) vybavenom kamerou K3 a energetickým filtrom Gatan BioQuantum. Mikroskop pracoval pri energii 300 keV, s nastavením energie 20 eV, veľkosťou pixelu vzorky 1,08 Å/pixel (nominálne zväčšenie 81 000x) a gradientom rozostrenia v rozsahu od -0,8 do -2,2 μm. Videozáznam sa vykonával pri frekvencii 40 snímok za sekundu pomocou mikroskopu Latitude S (Gatan) s nominálnou dávkovou rýchlosťou 25 e–px−1 s−1, expozičným časom 2,4 s a celkovou dávkou približne 60 e–Å−2.
Korekcia pohybu indukovaného lúčom a dávkové váženie sa vykonali na filme pomocou MotionCor2 v RELION 4.061. Odhad parametra funkcie prenosu kontrastu (CTF) sa vykonal v cryoSPARC s použitím metódy odhadu CTF založenej na patchoch62. Mikrofotografie s rozlíšením CTF fitovania ≥4 Å boli z následnej analýzy vylúčené. Typicky sa na výber bodov v cryoSPARC použila podmnožina 500 – 1 000 mikrofotografií, po ktorej nasledovalo niekoľko kôl 2D klasifikácie po filtrovaní, aby sa získal jasný referenčný obraz pre výber častíc na základe templátu. Častice sa potom extrahovali pomocou 64-pixelových ohraničujúcich rámčekov a 4-násobného binningu. Na odstránenie nežiaducich kategórií častíc sa vykonalo niekoľko kôl 2D klasifikácie. Počiatočný 3D model sa rekonštruoval pomocou ab initio rekonštrukcie a spresnil sa pomocou neuniformného spresňovania v cryoSPARC. 3D klasifikácia sa vykonala v cryoSPARC alebo RELION na základe heterogenity ARD. Nebola pozorovaná žiadna významná heterogenita membránových domén. Častice sa spresnili pomocou metód C1 a C2; Častice s vyšším rozlíšením C2 boli považované za symetrické vzhľadom na C2 a importované do RELIONu pre Bayesovské spresnenie. Častice boli potom prenesené späť do cryoSPARC pre konečné nerovnomerné a lokálne spresnenie. Konečné rozlíšenie a počet častíc sú uvedené v tabuľke 1.
Pri spracovaní pentamérov Nan+AP sme skúmali rôzne metódy na zlepšenie rozlíšenia membránových domén (najmä oblasti pórov), ako je odčítanie signálu a maskovanie TMD. Tieto pokusy však boli neúspešné kvôli potenciálne extrémnemu neusporiadaniu v oblasti pórov a celkovej heterogenite TMD. Konečné rozlíšenie bolo vypočítané pomocou masky automaticky generovanej metódou neuniformného spracovania v cryoSPARC, primárne zameranej na oblasť ARD. Tým sa dosiahlo výrazne vyššie rozlíšenie ako v prípade membránových domén (najmä oblasti VSLD).
Počiatočné de novo modely apo foriem baktérií Nanchung a Inactive boli najprv vygenerované pomocou Coot63 a modely baktérií Nan a Iav boli vygenerované pomocou AlphaFold264 na identifikáciu oblastí s nízkou spoľahlivosťou. Modelovanie kalmodulínu bolo založené na prispôsobení modelov viažucich Ca2+ a bez Ca2+ v PDB prístupoch 4JPZ56 a 1CFD65 rigidným telesom. Modely boli spresnené pomocou sférického spresnenia, aby sa zabezpečila správna stereochémia a dobrá geometria. Fosfatidylcholín, fosfatidyletanolamín a fosfatidylserín boli potom modelované ako dobre definované lipidové hustoty a ligandy NAM a AP boli umiestnené do zodpovedajúcich hustôt v tesných spojoch. Súbory s obmedzeniami boli vygenerované z reťazca SMILES izoforiem pomocou eLBOW v PHENIX66. Nakoniec boli modely spresnené v reálnom priestore v PHENIX pomocou lokálneho vyhľadávania v mriežke a globálnej minimalizácie s obmedzeniami sekundárnej štruktúry. Na spresnenie modelu a štrukturálnu analýzu bol použitý server MolProbity a ilustrácie boli vykonané pomocou PyMOL a UCSF Chimera X. 67, 68, 69 Analýza apertúry bola vykonaná pomocou servera HOLE, 70 a mapovanie konzervácie sekvencií bolo vykonané pomocou servera Consurf. 71
Štatistická analýza bola vykonaná pomocou programov Igor Pro 6.2, Excel Office 365 a GraphPad Prism 7.0. Všetky kvantitatívne údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná chyba (SEM). Na porovnanie dvoch skupín bol použitý Studentov t-test (obojstranný, nepárový). Na porovnanie viacerých skupín bola použitá jednofaktorová analýza rozptylu (ANOVA) nasledovaná Dunnettovým post hoc testom. *P< 0,05, **P< 0,01 a ***PHodnoty < 0,001 boli považované za štatisticky významné v závislosti od distribúcie údajov. Hodnoty Kd, Ki a ich asymetrické 95 % intervaly spoľahlivosti boli vypočítané pomocou GraphPad Prism 10.
Viac informácií o metodike štúdie nájdete v súhrne správy o portfóliu prírody, na ktoré odkazuje tento článok.
Počiatočný model bol zostavený s použitím kalmodulínových modelov z databáz PDB 4JPZ a 1CFD. Súradnice boli uložené v Protein Data Bank (PDB) pod prístupovými číslami 9NVN (Nan-Iav-CaM bez ligandu), 9NVO (Nan-Iav-CaM viazaný na nikotínamid), 9NVP (Nan-Iav-CaM viazaný na nikotínamid a EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM viazaný na afenidolpyrolín a vápnik), 9NVR (Nan-Iav-CaM viazaný na afenidolpyrolín a EDTA) a 9NVS (Nan pentamér viazaný na afenidolpyrolín). Zodpovedajúce snímky z kryoelektrónovej mikroskopie sú uložené v databáze elektrónovej mikroskopie (EMDB) pod nasledujúcimi prístupovými číslami: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM bez ligandu), EMD-49845 (komplex Nan-Iav-CaM s nikotínamidom), EMD-49846 (komplex Nan-Iav-CaM s nikotínamidom a EDTA), EMD-49847 (komplex Nan-Iav-CaM s afidopyrolínom a vápnikom), EMD-49848 (komplex Nan-Iav-CaM s afidopyrolínom a EDTA) a EMD-49849 (pentamérový komplex Nan s afidopyrolínom). V tomto článku sú uvedené nespracované údaje pre funkčnú analýzu.
Čas uverejnenia: 28. januára 2026