Rastlinné a patogénne materiály
Populáciu mapujúcu asociácie ciroku, známu ako konverzná populácia ciroku (SCP), poskytol Dr. Pat Brown z University of Illinois (teraz na UC Davis). Bola opísaná už skôr a ide o súbor rôznych línií konvertovaných na fotoperiodickú necitlivosť a menší vzrast, aby sa uľahčil rast a vývoj rastlín v prostredí USA. V tejto štúdii bolo použitých 510 línií z tejto populácie, hoci kvôli zlej klíčivosti a iným problémom s kontrolou kvality neboli všetky línie použité pri analýze všetkých troch znakov. Nakoniec boli údaje z 345 línií použité na analýzu chitínovej odpovede, 472 línií na odpoveď flg22 a 456 na rezistenciu TLS.B. cookeiKmeň LSLP18 bol získaný od Dr. Burta Bluhma z University of Arkansas.
Meranie odozvy MAMP
V tejto štúdii boli použité dva rôzne MAMP flg22 (katalóg Genscript č. RP19986) a chitín. Rastliny ciroku boli pestované vo vložkách umiestnených na plochách naplnených pôdou (33 % Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) v skleníku. Rastliny boli zaliate deň pred odberom vzoriek, aby sa predišlo nadmernej vlhkosti listov v deň odberu.
Línie boli randomizované a z logistických dôvodov boli vysadené v dávkach po 60 líniách. Pre každú líniu boli vysadené tri „kvetináče“ s dvoma semenami na líniu. Ďalšie dávky boli vysadené hneď po spracovaní predchádzajúcej dávky, až kým nebola vyhodnotená celá populácia. Pre oba MAMP boli vykonané dva experimentálne cykly s genotypmi opätovne randomizovanými v každom z dvoch cyklov.
ROS testy boli vykonané podľa predchádzajúceho opisu. Stručne povedané, pre každú líniu bolo šesť semien zasiatych do 3 rôznych kvetináčov. Z výsledných sadeníc boli vybrané tri na základe uniformity. Sadenice, ktoré vyzerali nezvyčajne alebo boli výrazne vyššie či kratšie ako väčšina, neboli použité. Z najširšej časti 4. listu troch rôznych 15-dňových rastlín ciroku boli vyrezané štyri listové disky s priemerom 3 mm. Jeden disk na list z dvoch rastlín a dva disky z jednej rastliny, pričom druhý disk sa stal kontrolnou vzorkou s vodou (pozri nižšie). Disky boli jednotlivo umiestnené na 50 µl H20 v čiernej 96-jamkovej platni, utesnené hliníkovým uzáverom, aby sa zabránilo vystaveniu svetlu, a uchovávané cez noc pri izbovej teplote. Nasledujúce ráno sa pripravil reakčný roztok s použitím 2 mg/ml chemiluminiscenčnej sondy L-012 (Wako, katalógové číslo 120-04891), 2 mg/ml chrenovej peroxidázy (typ VI-A, Sigma-Aldrich, katalógové číslo P6782) a 100 mg/ml chitínu alebo 2 μM Flg22. Do troch zo štyroch jamiek sa pridalo 50 µl tohto reakčného roztoku. Štvrtá jamka slúžila ako kontrolná vzorka, do ktorej sa pridal reakčný roztok bez MAMP. V každej platni boli tiež štyri slepé jamky obsahujúce iba vodu.
Po pridaní reakčného roztoku sa luminiscencia merala pomocou multidetekčného mikroplatničkového čítača Synergy™ 2 (BioTek) každé 2 minúty počas 1 hodiny. Čítačka platní vykonáva merania luminiscencie každé 2 minúty počas tejto 1 hodiny. Súčet všetkých 31 odčítaní sa vypočítal, aby sa získala hodnota pre každú jamku. Odhadovaná hodnota MAMP odpovede pre každý genotyp sa vypočítala ako (priemerná hodnota luminiscencie troch experimentálnych jamiek – hodnota z kontrolnej jamky) mínus priemerná hodnota z jamky slepej vzorky. Hodnoty z jamiek slepej vzorky boli konzistentne blízke nule.
Listové diskyNicotiana benthamiana, jedna vysoko citlivá ciroková línia (SC0003) a jedna nízko citlivá ciroková línia (PI 6069) boli tiež zahrnuté ako kontroly do každej 96-jamkovej platne na účely kontroly kvality.
B. cookeipríprava inokula a inokulácia
B. cookeiInokulum sa pripravilo podľa predchádzajúceho opisu. Stručne povedané, zrná ciroku sa namočili na tri dni do vody, opláchli, nabrali do 1-litrových Erlenmeyerových baniek a autoklávovali sa jednu hodinu pri tlaku 15 psi a teplote 121 °C. Zrná sa potom naočkovali približne 5 ml macerovaného mycélia z čerstvej kultúry.B. cookeiIzoláty LSLP18 a ponechané 2 týždne pri izbovej teplote, pričom sa banky pretrepávali každé 3 dni. Po 2 týždňoch boli zrná ciroku napadnuté hubou vysušené na vzduchu a potom uskladnené pri teplote 4 °C až do inokulácie na poli. Rovnaké inokulum sa použilo počas celého pokusu a každý rok sa pripravovalo čerstvé. Na inokuláciu sa 6 – 10 napadnutých zŕn umiestnilo do závitku 4 – 5 týždňov starých rastlín ciroku. Spóry produkované týmito hubami iniciovali infekciu v mladých rastlinách ciroku do jedného týždňa.
Príprava semien
Pred výsadbou na pole boli semená ciroku ošetrené zmesou fungicídov, insekticídov a safenerov obsahujúcou ~ 1 % fungicídu Spirato 480 FS, 4 % fungicídu Sebring 480 FS a 3 % safeneru na semená Sorpro 940 ES. Potom boli semená sušené na vzduchu 3 dni, čo zabezpečilo tenkú vrstvu tejto zmesi okolo semien. Safener umožnil použitie herbicídu Dual Magnum ako preemergentného ošetrenia.
Hodnotenie odolnosti cieľovej škvrnitosti listov
Semienka ciroku boli vysadené v Centrálnej výskumnej stanici pre plodiny v Claytone v Severnej Karolíne 14. – 15. júna 2017 a 20. júna 2018 v randomizovanom blokovom dizajne s dvoma experimentálnymi opakovaniami v každom prípade. Experimenty boli vysadené v jednotlivých riadkoch s rozlohou 1,8 m a šírkou riadku 0,9 m s použitím 10 semien na parcelu. Po obvode každého experimentu boli vysadené dva okrajové riadky, aby sa predišlo okrajovým efektom. Experimenty boli naočkované 20. júla 2017 a 20. júla 2018, kedy boli rastliny ciroku v rastovom štádiu 3. Hodnotenie sa uskutočňovalo na stupnici od jednej do deviatich, kde rastliny bez známok choroby boli hodnotené ako deväť a úplne mŕtve rastliny ako jedna. V roku 2017 boli vykonané dve hodnotenia a v roku 2018 štyri merania, počnúc dvoma týždňami po naočkovaní každý rok. sAUDPC (štandardizovaná plocha pod krivkou progresie choroby) bola vypočítaná podľa predchádzajúceho opisu.
Čas uverejnenia: 1. apríla 2021