Rastlinné a patogénne materiály
Sorghum Association mapujúca populáciu známu ako ciroková konverzia populácie (SCP) poskytla Dr. Pat Brown z University of Illinois (teraz na UC Davis).Bol opísaný už skôr a ide o súbor rôznych línií prevedených na fotoperiodickú necitlivosť a menšieho vzrastu, aby sa uľahčil rast a vývoj rastlín v prostredí USA.V tejto štúdii sa použilo 510 línií z tejto populácie, hoci v dôsledku zlého klíčenia a iných problémov s kontrolou kvality neboli pri analýze všetkých troch znakov použité všetky línie.Nakoniec sa na analýzu chitínovej odpovede použili údaje z 345 línií, 472 línií pre odpoveď flg22 a 456 pre TLS rezistenciu.B. Cookeikmeň LSLP18 bol získaný od Dr. Burta Bluhma z University of Arkansas.
Meranie odozvy MAMP
V tejto štúdii boli použité dva rôzne MAMP flg22 (Genscript Catalog # RP19986) a chitín.Rastliny ciroku sa pestovali vo vložkách položených na plochách naplnených pôdou (33 % Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) v skleníku.Rastliny sa zaliali deň pred odberom vzoriek, aby sa zabránilo nadmernej vlhkosti listov v deň odberu.
Línie boli náhodné a z logistických dôvodov boli vysadené v dávkach po 60 líniách.Pre každú líniu sa vysadili tri „hrnce“ s dvoma semenami na líniu.Nasledujúce šarže sa vysadili hneď po spracovaní predchádzajúcej šarže, kým nebola vyhodnotená celá populácia.Uskutočnili sa dva experimentálne cykly pre oba MAMP s genotypmi rerandomizovanými v každom z dvoch behov.
ROS testy sa uskutočňovali tak, ako bolo opísané vyššie.Stručne povedané, pre každú líniu bolo zasadených šesť semien do 3 rôznych kvetináčov.Z výsledných sadeníc sa vybrali tri na základe jednotnosti.Sadenice, ktoré vyzerali nezvyčajne alebo boli výrazne vyššie alebo nižšie ako väčšina, sa nepoužili.Z najširšej časti 4. listu troch rôznych 15-dňových rastlín ciroku boli vyrezané štyri listové kotúče s priemerom 3 mm.Jeden kotúč na list z dvoch rastlín a dva kotúče z jednej rastliny, pričom druhý kotúč sa stane kontrolou vody (pozri nižšie).Disky boli jednotlivo plávané na 50 ul H20 v čiernej 96-jamkovej doštičke, utesnené hliníkovým uzáverom, aby sa zabránilo vystaveniu svetlu, a udržiavané pri teplote miestnosti cez noc.Nasledujúce ráno sa pripravil reakčný roztok s použitím 2 mg/ml chemiluminiscenčnej sondy L-012 (Wako, katalógové č. 120-04891), 2 mg/ml chrenovej peroxidázy (Typ VI-A, Sigma-Aldrich, katalógové č. P6782) a 100 mg/ml chitín alebo 2 uM Flg22.50 ul tohto reakčného roztoku sa pridalo do troch zo štyroch jamiek.Štvrtá jamka bola falošná kontrola, do ktorej sa pridal reakčný roztok s výnimkou MAMP.Do každej platne boli tiež zahrnuté štyri prázdne jamky obsahujúce iba vodu.
Po pridaní reakčného roztoku sa merala luminiscencia použitím čítačky mikrodoštičiek SynergyTM 2 s viacerými detekciami (BioTek) každé 2 minúty počas 1 hodiny.Čítačka doštičiek vykonáva merania luminiscencie každé 2 minúty počas tejto 1 hodiny.Vypočítal sa súčet všetkých 31 meraní, aby sa získala hodnota pre každú jamku.Odhadovaná hodnota odozvy MAMP pre každý genotyp sa vypočítala ako (priemerná hodnota luminiscencie troch experimentálnych jamiek - hodnota falošnej jamky) mínus priemerná hodnota slepej jamky.Hodnoty slepých jamiek boli konzistentne blízke nule.
Listové kotúče zNicotiana benthamiana, jedna vysoko citlivá ciroková línia (SC0003) a jedna slabo citlivá ciroková línia (PI 6069) boli tiež zahrnuté ako kontroly v každej 96-jamkovej doštičke na účely kontroly kvality.
B. Cookeipríprava inokula a očkovanie
B. Cookeiinokulum sa pripravilo tak, ako bolo opísané vyššie.Stručne, zrná ciroku boli namočené vo vode na tri dni, opláchnuté, naberané do 1 1 kužeľových baniek a autoklávované jednu hodinu pri 15 psi a 121 °C.Zrná sa potom naočkovali asi 5 ml macerovaného mycélia z čerstvej kultúryB. CookeiLSLP18 sa izoluje a nechá sa 2 týždne pri izbovej teplote, pričom sa banky každé 3 dni pretrepávajú.Po 2 týždňoch sa zrná ciroku napadnuté hubou vysušili na vzduchu a potom sa skladovali pri 4 °C až do poľnej inokulácie.Rovnaké inokulum sa použilo na celý pokus a vyrábalo sa čerstvé každý rok.Na očkovanie sa 6–10 napadnutých zŕn umiestnilo do prasliaka 4–5 týždňov starých rastlín ciroku.Spóry produkované týmito hubami iniciovali infekciu v mladých rastlinách ciroku do týždňa.
Príprava semien
Pred výsadbou na poli bolo osivo ciroku ošetrené zmesou fungicídu, insekticídu a safenera s obsahom ~ 1 % fungicídu Spirato 480 FS, 4 % fungicídu Sebring 480 FS, 3 % prostriedku na ochranu osiva Sorpro 940 ES.Potom sa semená sušili na vzduchu počas 3 dní, čím sa vytvoril tenký povlak tejto zmesi okolo semien.Safener umožnil použitie herbicídu Dual Magnum ako preemergentné ošetrenie.
Hodnotenie odolnosti voči Target Leaf Spot
SCP bol vysadený na Central Crops Research Station v Claytone, NC 14. – 15. júna 2017 a 20. júna 2018 v randomizovanom kompletnom blokovom dizajne s dvoma experimentálnymi replikáciami v každom prípade.Pokusy boli vysadené v 1,8 m jednotlivých radoch so šírkou 0,9 m s použitím 10 semien na pozemok.Po obvode každého experimentu boli vysadené dva hraničné rady, aby sa zabránilo okrajovým efektom.Experimenty boli naočkované 20. júla 2017 a 20. júla 2018, kedy boli rastliny ciroku v rastovom štádiu 3. Hodnotenia sa uskutočnili na stupnici od jednej do deviatich, kde rastliny nevykazujúce žiadne známky choroby boli hodnotené ako deväť a úplne mŕtve rastliny boli hodnotené ako jedna.V roku 2017 sa vykonali dve hodnotenia a v roku 2018 sa uskutočnili štyri odčítania, ktoré sa začali každý rok dva týždne po očkovaní.sAUDPC (štandardizovaná plocha pod krivkou progresie ochorenia) sa vypočítala tak, ako je opísané vyššie.
Čas odoslania: apríl-01-2021